[发明专利]纤维化的联合生物标志物测量

说明书

本文提供了用于检测交联的PIIINP的夹心免疫测定法，交联的PIIINP具有通过链间交联连接在一起的至少两条PIIINP链，每条链具有由完整的III型前胶原的N蛋白酶切割产生的PIIINP的C末端新表位。具有交联的PIIINP的生物样品与第一表面结合单克隆抗体接触，然后与第二单克隆抗体接触，两种抗体都是与PIIINP的C末端序列中的新表位特异性反应的，并且然后测定第二单克隆抗体的结合。还提供了一种通过免疫测定和试剂盒评估靶向赖氨酰氧化酶的拮抗剂药物的功效的方法，试剂盒包含结合第一单克隆抗体的固体载体并且包含第二单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及用于检测在生物样品中交联的PIIINP的夹心免疫测定及其在评估靶向赖氨酰氧化酶(LOX)的药物功效中的用途。本发明还涉及用于进行夹心免疫测定的试剂盒。

背景技术

纤维化疾病(包括表1中列出的疾病)是发病和死亡的主要原因，例如，全球每年有800,000人死于肝硬化(1)。

表1.不同的纤维化疾病(2)

“纤维化疾病”是任何引起无论是作为主要还是次要症状的纤维化的疾病。纤维化是由多种刺激引起的慢性炎症反应的最终结果，刺激包括持续感染、自身免疫反应、过敏反应、化学损伤、辐射和组织损伤。纤维化的特征在于细胞外基质(ECM)的积聚和重组。尽管有明显的病因和临床特性，但大多数慢性纤维化病症都有一个共同点，都具有持续性刺激物质，该刺激物质维持生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维化细胞因子的产生，这些刺激物质一起刺激结缔组织成分的沉积，特别是胶原和蛋白多糖，这逐步重构和破坏正常的组织结构(3、4)。尽管它对人类健康有巨大的影响，但目前还没有经批准的直接针对纤维化机制的治疗(5)。

细胞外基质(ECM)

ECM是一种超分子结构，具有形成蛋白质聚集体的能力，因此形成在三维网络中将细胞连接在一起的动态支架。该支架通过上调和下调蛋白酶来控制细胞-基质相互作用和细胞命运(6)。ECM由胶原、层粘连蛋白、蛋白多糖和其他糖蛋白以各种数量和组合组成，从而提供多种生物成分，该成分可被蛋白酶修饰以产生具有特定功能的支架来满足个体组织的需求(7)。

Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是人体内主要的结构蛋白质。III型胶原对于心血管系统和其他器官中的I型胶原的原纤维的生成是必需的(8、9)。在纤维组装期间，在将成熟胶原并入ECM中之前，III型前胶原的N末端前肽(由三条相同的α链组成，总共分子量为42kDa)被特异性N蛋白酶切割。切割的前肽可以保留在ECM中或释放到循环中。然而，前肽的切割有时是不完全的，使前肽附连至分子。这导致形成具有异常交联的细纤维，这反过来导致异常分子容易发生快速代谢更新(10、11)。因此，合适样品中III型胶原的N末端前肽(PIIINP)的水平可以作为III型胶原形成和/或降解的标志物。

ECM的重构在各种疾病的发病机理中起重要作用，因为ECM改变的成分和非编码修饰引起组织僵硬以及完整ECM及其片段的信号电位的变化。ECM重构是组织功能和修复的重要前提，并由负责ECM合成和降解的酶的严格控制。

在病理事件期间，诸如纤维化疾病，ECM的形成和降解之间的平衡受到干扰，引起ECM的组成改变。这种改变导致组织功能改变(12、13)。已经提出PIIINP可以用作几种纤维化疾病的生物标志物，诸如肺损伤(14)、病毒性和非病毒性肝炎(15)、系统性硬化症(16)、血管重构(17)和肾病(18)。