[发明专利]转化体、以及转铁蛋白的制造方法

说明书

本发明提供使用粟酒裂殖酵母的转化体、以高生产性分泌产生转铁蛋白的方法、以及适合该方法的转化体。转化体的特征在于，将粟酒裂殖酵母作为宿主，具有转铁蛋白基因，和存在于转铁蛋白基因的上游区域、使与在宿主内起作用的分泌信号肽结合的转铁蛋白表达的分泌信号肽基因，宿主本来具有的gas2基因被删除或失活；并且转铁蛋白的制造方法的特征在于，在液体培养基中培养转化体，从该液体培养基取得转铁蛋白。

技术领域

本发明涉及将Schizosaccharomyces pombe(以下，称为“粟酒裂殖酵母”。)作为宿主、使用整合了转铁蛋白基因的转化体、制造转铁蛋白的方法。

背景技术

转铁蛋白(以下，也称为“TF”。)是与Fe³⁺离子结合的糖蛋白的1种，与铁的代谢密切相关。尤其，人血清转铁蛋白(以下，也称为“人转铁蛋白”或“hTF”。)属于人体内的铁结合蛋白质家族，参与体内的铁运输·代谢，用作对动物细胞的培养用培养基的添加剂、医药品、DDS的运输载体。TF是具有N臂(N-lobe)和C臂(C-lobe)2个结构域的约80kDa的糖蛋白，通过翻译作为在N末端具有分泌信号肽的未成熟型蛋白质被合成后，作为切断了分泌信号肽的成熟型的糖蛋白向细胞外分泌。

作为TF生产的最通常的方法，已知使用仓鼠肾脏细胞(BHK细胞)等哺乳细胞的培养株生产全长重组蛋白质的方法。此外，已知使用作为裂殖酵母的粟酒裂殖酵母的方法。粟酒裂殖酵母与作为出芽酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不同，细胞分裂以及转录形态与人细胞接近，不含有对人体有不良影响的物质。因此，在粟酒裂殖酵母中生产TF的全长重组蛋白质的方法作为医药品等被人摄取的TF的生产方法是优良的。例如，专利文献1中公开了将粟酒裂殖酵母作为宿主，在含有酪蛋白氨基酸的液体培养基中培养导入了hTF基因的转化体，高效地生产hTF，在液体培养基中使其分泌、回收的方法。

另一方面，已知在使用酵母等真核细胞微生物的异源蛋白质生产体系中，为了提高目标异源蛋白质的生产效率，使用将对于异源蛋白质生产而言不需要或不利的宿主的基因组部分的一部分或全部删除或失活了的改良宿主。例如，专利文献2中记载了通过在粟酒裂殖酵母中使用将选自编码特定的蛋白酶的基因(蛋白酶基因簇)的至少1种的基因删除或失活了的改良宿主，提高异源蛋白质的生产效率。

此外，可通过在hTF蛋白质的N末端上附加了分泌信号(内质网迁移信号)肽的状态下进行生产，来分泌生产hTF蛋白质。例如，如果培养导入了编码融合蛋白质的结构基因的粟酒裂殖酵母的转化体，则生产的该融合蛋白质在高尔基体或内质网中分泌信号肽被切断，hTF蛋白质被分泌至培养基中；该融合蛋白质在hTF蛋白质的N末端融合有像来源于与粟酒裂殖酵母的接合相关的接合信息素(P-因子)的前体的分泌信号的多肽那样、通过粟酒裂殖酵母而被识别的分泌信号肽。例如专利文献3中，记载了通过在目标外源蛋白质的N末端侧上融合有由作为具有分子伴侣功能、集中于内质网的蛋白质的PDI1(蛋白质二硫键异构酶1，Protein disulfide isomerase 1)的分泌信号肽和a结构域和b结构域和x结构域构成的部分蛋白质，或由PDI1的内质网迁移信号肽和a结构域和b结构域和b’结构域和x结构域构成的部分蛋白质的状态下使其表达，使粟酒裂殖酵母中外源蛋白质分泌生产的量增大。另外，PDI1从N末端起依次具有ER迁移信号、a结构域、b结构域、b’结构域、x结构域、a’结构域、以及包含ER定位信号(ADEL)的c结构域。a结构域以及a’结构域中各有1个分子伴侣活性的活性中心(CGHC)，a结构域、b结构域、b’结构域、以及a’结构域4者一起形成硫氧还蛋白折叠。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2011-125281号公报

专利文献2：国际公开第2007/015470号

专利文献3：国际公开第2013/111754号

发明内容

发明所要解决的技术问题