[发明专利]产生病毒的方法

说明书

提供了产生、繁殖和增殖病毒的方法，鉴定样品中病毒存在的方法，特别是使用日本鳗鱼细胞培养物的方法。还提供了分离的日本鳗鱼细胞培养物，其任选地用病毒感染，包含根据本发明方法生长的病毒的疫苗，和包含日本鳗鱼细胞培养物的用于繁殖病毒的试剂盒。该病毒可以是鱼类病毒，如野田村病毒、感染性胰腺坏死病毒(IPNV)和鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)。

本发明涉及产生和繁殖病毒，特别是鱼类病毒的方法。本发明还涉及用于产生和繁殖病毒的方法的细胞培养物和包含通过其方法制备的病毒的疫苗。

通过水产养殖进行的鱼类工业化养殖正在急剧扩张。由病原体引起的传染病是工业水产企业必须克服的主要问题。鱼类病原体可能是真菌、原生动物、细菌原或病毒，但是鱼类养殖者、孵化场管理者和科学家最关心的是病毒性疾病，因为它们在很大程度上是无法控制的并且可能造成重大的经济损失。

鱼类易受各种病毒感染和疾病的影响，其中一些包括感染性胰腺坏死病毒(IPNV)，支柱细胞坏死病毒(PCNV)，野田村病毒或病毒性神经坏死(VNN)，鲑鱼胰腺疾病病毒(SPDV)，感染性造血组织坏死病毒(IHNV)，病毒性出血性败血症病毒(VHSV)，感染性皮下和造血坏死病毒(IHHNV)，虾白斑病毒(WSV)，桃拉综合征病毒(TSV)，肝胰腺细小病毒(HPV)，感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)，以及以下科中的其他病毒：双RNA病毒科(Birnaviridae)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)；虹膜病毒科(Iridoviridae)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)；Ortomixovirus；Paramixovirus；动脉病毒属(Arterivirus)；和微小核糖核酸病毒(Picornavirus)。

开发有效的疫苗是降低由鱼类病毒感染引起的高死亡率和经济损失的解决方案。然而，生产灭活疫苗的成本很高，因为它需要大量培养病毒然后灭活。

本领域已知的疫苗生产方法包括使用胚胎卵(例如鸟胚)、细胞(组织)培养物(TC)、活动物接种和/或使用转基因动物。使用植物、昆虫细胞或细菌培养物的研究方法也是已知的。

这些方法中的每一种都有其优点和缺点。例如，与基于卵的疫苗相比，基于细胞的疫苗的生产时间显著减少，而相较而言基于细胞的疫苗具有相对高的制造成本和低产率。

用于病毒繁殖的几种细胞培养物是已知的，例如，上皮瘤丘疹鲤科鱼(EPC)、蓝鳃鱼苗尾鳍(BF-2)、石斑鱼Epinephelus coioides(GF-1)、条纹蛇头鱼苗(SSN-1)、金头鲷尾鳍(SAF-1)、虹鳟性腺2(RTG-2)、Chinook鲑鱼胚(CHSE-214)和亚洲石斑鱼株(AGK)细胞。

本发明提供了改进的产生和繁殖病毒的方法，其克服了现有技术中的一些问题。

本发明的第一方面提供了一种繁殖病毒的方法，包括以下步骤：

用病毒感染合适的细胞培养物；

培养感染的细胞培养物；

收获病毒；和

任选地纯化病毒，

其中所述细胞培养物是日本鳗鱼细胞培养物。

在本发明的实施方案中，细胞培养物可包含混合细胞系，即两种或更多种细胞系的混合物，或单一细胞系。

日本鳗鱼细胞培养物可包含单个细胞类型或两种或更多种细胞类型的混合物。例如，日本鳗鱼细胞培养物可包含上皮细胞和/或成纤维细胞。在一些实施方案中，细胞培养物包含上皮细胞和成纤维细胞。

优选地，细胞培养物是来源于由申请人在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)以保藏号16062701保藏的命名为日本鳗-K(Anguilla japonica-K)的日本鳗(Anguillajaponica)的细胞培养物。