[发明专利]用于高吞吐量成像的方法和设备

说明书

用于对样本成像的设备，所述设备包括：照明装置，其用于在线焦点或焦点阵列中同时照明所述样本；以及检测装置，其用于检测在视场阵列中同时从样本发射或散射的光子；其中样本中的在成像期间从其中发射或散射光子的子观察体积的阵列由其中来自照明装置的线焦点或焦点阵列与检测装置的相应视场阵列重叠的空间中的体积限定；样本保持器，优选为圆柱形样本保持器，其被配置为将样本保持在其表面处，所述样本保持器可旋转地布置成使得通过旋转样本保持器可以将所述样本的至少一部分传输通过所述子观察体积中的至少一个。

技术领域

本发明提供用于从主要有机物质但不排除无机物质以及从该物质中的化学、生物化学或生物反应、相互作用、途径或序列中检测、监测、成像和获取数据的方法和装置。特别地，本发明提供用于例如在包括活细胞的细胞中、在活组织中和在含有机物质的溶液中以每个样本的较低成本和高吞吐量以在三维中的高空间分辨率来研究所述物质的方法和设备。特别针对的另一个应用是监测包括活细胞的细胞中或溶液中DNA和RNA相关的活性的可能性。

背景

存在用于对生物样本成像的太多的方法和设备。主要地，这些是由Marvin Minsky在1957年获得专利的共聚焦显微镜的变型。共聚焦显微镜的普及性是由于其切片(sectioning)能力，其实现了比常规宽视场显微镜可以实现的三维上的相对高的分辨率和更好的对比度。通常，共聚焦显微镜与荧光光谱结合，其中特定的颗粒(例如，蛋白质)用荧光团标记，并因此可以从背景中辨别。

在大多数共聚焦显微镜中，相同的光学器件(至少相同的物镜)用于照明/激发和用于观察/检测来自所研究的样本的光。这种配置的优点在于其模拟经典宽视场显微镜的设计，并因此可以使用或多或少的相同光学部件。另一个优点在于照明和检测自动对准。另外的优点在于，通过用垂直于样本表面的视场轴线照明和观察，N.A可以是大的，而不会遇到诸如全反射的问题。

然而，常规共聚焦显微镜的这种几何结构引入限制可以被处理的应用的频谱的弱点和权衡。

在共聚焦显微镜中，通过限制允许所发射的光到达检测器的体积(观察体积)来获得分辨率，即两个可区分的辐射点之间的距离。限制观察体积通过结合两种方法来实现：在正交于显微镜的照明(或等效于视场)轴线的维度中，观察体积的扩展由物镜的焦平面中的聚焦宽度确定。在沿着物镜的照明轴线(视场轴线)的维度中，观察体积由放置在检测器前面的光学共轭平面中的针孔的宽度确定。该针孔做得足够小以阻挡沿着照明轴线的方向从距焦平面一定距离之外的点发出的光。这样，通过选择具有非常小的聚焦宽度的物镜和小且正确定位的针孔，可以获得所有三维上的非常高的分辨率。使用针孔的另一个优点在于它增强了对比度，因为从位于观察体积之外的样本的被照射部分发出的散射光或荧光不会到达检测器。

尽管如此，在实践中，这意味着严重权衡：用于滤出从焦平面之外发出的光的针孔限制物镜在该时刻处对在焦平面中的多于一个点进行成像。因此，为了获得图像，必须使样本和观察体积相对于彼此移动(扫描)。图像是逐点合成的，并且1024×1024帧可能花费超过一秒钟来获取。这使得并行化成像并从而实现高吞吐量的可能性复杂化。

如上所述，常规共聚焦显微镜中的观察体积通过将小聚焦宽度与针孔技术组合来确定。在三维空间中创建观察体积的另一种方法是使用所谓的共聚焦θ显微镜，Stelzer、EHK等人于1994年在Opt Commun.111第536-547页上发表的“Fundamental reduction inthe observation volume in far-field light microscopy by detection orthogonalto the illumination axis:confocal theta microscopy”。在该技术中，通过使用两个物镜来代替地确定观察体积，两个物镜被放置成使得它们的视场的轴线正交并且使得它们的焦平面相交。因此，观察体积由在一个方向上一个检测器的聚焦宽度和在正交的第二方向上第二检测器的聚焦宽度来限制。在这种情况下的照明可以是任意的，只要它照亮感兴趣的观察体积即可。