[发明专利]利用双光子激发荧光的生物亲和性测定方法

权利要求书

1.一种用于定性和/或定量测定生物流体或悬浮液的样品中的分析物(4)的无分离的生物分析测定方法，所述方法包括以下步骤：

a) 使包含对所述分析物(4)生物特异性的第一试剂(2)所结合的微粒(1)的生物亲和性固相与所述样品和对用荧光标记物标记的所述分析物(4)生物特异性的第二试剂(3)在反应体积中同时接触，从而引发反应，

b) 使用光束偏转扫描仪和由光学移动微粒(1)的聚焦激光束产生的双光子激发体积扫描所述反应体积内的双光子激发焦点体积，

c) 当所述双光子激发体积接近随机位于反应体积中的微粒(1)时，暂时中断所述双光子激发焦点体积的扫描或降低所述双光子激发焦点体积的扫描速度，

d) 对所述微粒(1)施加光学力使得它移动到由所述激光束产生的双光子激发体积中并在其中移动，和

e) 检测来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数；

其特征在于，所述方法还包括：

f) 记录设备的多个所述微粒(1)的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数；

g) 通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算所述设备的校正矩阵，和

h) 通过采用所述校正矩阵校正来自所述设备的所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数，所述校正矩阵通过采用所述记录的聚焦位置和所述相应的双光子激发的荧光发射计数对于所述设备获得。

2.权利要求1的方法，其特征在于，通过采用在所定义的在先时间段内记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数，连续地或以预设的间隔或时间点重新计算校正矩阵。

3.权利要求2的方法，其特征在于，选择在先时间段，以便在计算所述设备的校正矩阵时采用最小数量的微粒(1)的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数。

4.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，通过采用来自至少一个阴性对照样品，即不含分析物(4)的一个或多个样品的微粒(1)的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数来计算校正矩阵。

5.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于，通过采用临床样品测量的记录的聚焦位置和相应的双光子激发的荧光发射光子计数和仅采用具有在分析物(4)的阳性结果的截止值的预定裕度内的双光子激发的荧光发射光子计数的粒子来计算校正矩阵。

6.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，来自单个粒子(1)的双光子激发的荧光发射光子计数针对在单个孔(20)的测量期间获得的荧光发射光子计数的中值进行归一化。

7.权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，通过计算校正因子的n×m矩阵来近似化校正矩阵，其中对于校正矩阵的每个位置，从来自所述微粒(1)的双光子激发的荧光发射光子计数来计算近似校正值，所述微粒在距所述位置的设定半径内检测到。

8.权利要求7的方法，其特征在于，所述近似校正值是双光子激发的荧光发射光子计数的中值。

9.前述权利要求中任一项的方法，其特征在于，应用校正矩阵中的变化来确定设备的健康，即设备健康中的变化和/或设备维护需求。

10.权利要求9的方法，其特征在于，如果所述校正矩阵变化超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。

11.权利要求9的方法，其特征在于，如果所述校正矩阵的变化速度超过设定极限，则将设备退出使用直到维护。