[发明专利]立体细胞组织的制造方法

说明书

一种制造立体细胞组织的方法，其包含以下工序：将细胞与阳离子性物质及细胞外基质成分混合而获得混合物的A工序；从所得的所述混合物中收集所述细胞、在基材上形成细胞集合体的B工序；以及培养所述细胞而获得立体细胞组织的C工序。

技术领域

本发明涉及立体细胞组织的制造方法。

本申请基于在2016年2月22日于日本申请的日本特愿2016-030916号主张优先权，将其内容援引于此。

背景技术

近年来，再生医疗原本在要求接近于生物体环境的药剂分析体系中，相比较于在平板上生长的细胞、使用立体地组织化而成的三维细胞组织更显示优势。因此，开发了用于在生物体外构建细胞的三维组织的各种技术。例如，开发了在细胞无法附着的表面基板上形成团块的方法(专利文献1)；在液滴中形成团块的方法(专利文献2)；使细胞聚集在透过性膜上的方法(专利文献3)等。为了维持这种细胞的组织化，生物体自身产生的胶原等细胞外基质(ECM)对于细胞间的结合或支架形成是必要的。因此，探讨了在人为地构建细胞组织时从外部添加ECM(专利文献4～7)。专利文献5中公开了使通过酶处理等分离出的细胞与作为代表性ECM的具有细胞保护作用的水溶性高分子的胶原等接触之后，以三维集合体进行培养的方法。根据该方法，在培养中在细胞周边形成水溶性高分子的凝胶。

专利文献8及非专利文献1中公开了下述方法：使用表面固定有温度响应性树脂poly(N-isopropylacrylamide)(PIPAAm，聚(N-异丙基丙烯酰胺))的培养皿制作细胞片材，将所制作的细胞片材进行层叠，从而构建三维组织。该方法虽然细胞片材的剥离是必须的，但难以在维持细胞形状的同时进行剥离。

非专利文献2中公开了使用含有与细胞膜发生静电相互作用的纳米磁性微粒的磁性阳离子脂质体(MCL)来构建细胞的三维组织的方法。但是，该方法难以控制细胞层的厚度或三维配置。

专利文献9中公开了下述方法：通过反复进行细胞层的形成、和使所述细胞层与第1物质含有液及第2物质含有液交替接触的工序，介由纳米尺寸厚度的ECM(细胞外基质)连续地将细胞层层叠，从而构建三维组织。该方法中，由于不需要单层细胞片材的剥离或剥离后的细胞片材的重叠等，因此能够以优异的重现性和效率制造三维组织。但是，由于要一层层地对细胞层进行培养，因此三维组织的构建需要很长时间。另外，由于难以在同一平面内进行多种细胞的配置，因此三维配置的变化有限。

专利文献10中公开了下述方法：制作细胞的表面整体被粘接膜覆盖了的被覆细胞，介由粘接膜使细胞粘接，从而构建三维组织。该方法中，为了制作被覆细胞，多次的离心分离工序是必要的。因而，根据细胞种类不同，有受到物理损伤的可能。另外，还有伴随着离心分离时的上清除去而细胞有所损失、细胞的回收率降低的情况。

本发明人们以前发现了，通过将正常人皮肤纤维母细胞(NHDF)与纤连蛋白(FN)、肝素(Hep)或硫酸葡聚糖(DS)混合，接着将混合物供至离心分离，从而形成凝胶样的细胞集合体(非专利文献3)。另外，通过将该凝胶样的细胞集合体用于专利文献10所记载的方法，构建了三维组织。但是，上述方法难以获得厚的组织。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4159103号说明书

专利文献2：日本专利第5847733号说明书

专利文献3：日本专利第5669741号说明书

专利文献4：日本特开昭63-222685号公报

专利文献5：日本专利第2824081号说明书

专利文献6：日本专利第5458259号说明书

专利文献7：日本专利第5409009号说明书

专利文献8：国际公开第2002/008387号