[发明专利]采用双探针邻近性连接系统的多重单分子RNA可视化

说明书

SNAIL提供了单细胞中的特定核酸的有成本效益的检测，并且可与流式细胞术组合以针对多个核酸同时分析大量细胞，例如，能够以高达约50、100、250、500或更多个细胞/秒的速率同时分析至少一种至高达5种、高达10种、高达15种、高达20种或更多种转录物。所述方法仅需要两种引物用于扩增，且可进一步包括检测引物。

发明背景

对基因表达调控机制的研究是理解其失调是如何引起疾病状况所必需的。信使RNA(mRNA)的空间分布在细胞和组织水平下都受到严格调控。对mRNA的丰度和空间分布的分析常常受到可通过常规的显微镜同时检测的荧光团数量或费力、费时且昂贵的方法的限制。在单细胞中的特异性mRNA分子的检测通常涉及cDNA的产生(例如FISSEQ技术)，或在cDNA上的挂锁探针连接，继之以滚环扩增，由此敏感性受到低效率的逆转录酶的限制。

或者，单分子RNA检测可利用多个短的荧光标记核苷酸探针直接与靶mRNA(例如单分子RNA-FISH)的杂交。这些方法具有必须合成多个探针的缺点；且这种探针一般需要靶向开放阅读框。

最近，我们公开了基于邻近性的RNA检测技术PLAYR，其能够实现在CyTOF上的单细胞RNA检测。然而，问题在于PLAYR涉及复杂的四探针系统，该系统需要两步杂交且特征为中间杂交特异性序列，其使探针设计过程变复杂。另外，各基因需要不同的中间杂交序列，且每个新的序列必须被独立地测试以确保连接的效率和不存在串话(cross-talk)，这使得高度多重实验的设计成为一项艰巨任务。

使用微阵列技术或高通量测序的基因表达的高通量测量对于我们关于以下的理解做出了极大的贡献：基因网络是如何在正常细胞和组织中协调地发挥作用及它们是如何在疾病中功能失常的。这种测量使得能够推断基因基于它们的表达模式的功能，以便检测哪些基因在疾病中有改变的表达并且鉴别作为疾病进展前兆的表达特征。然而，大多数转录物组测量仅探知样品中的平均基因表达。因此，在含有具有不同基因表达特征的若干细胞类型的复杂样品中，仅将捕获最丰富，而不一定是最有意义的特征。因此，在大多数生物系统且特别是组织和肿瘤中的单细胞基因表达的可变性导致需要旨在表征所关注的单个细胞中的基因表达程序的技术。

对于单细胞测量的重要性的认识的提高反映在数量巨大的单细胞分析平台中，该分析平台近年来已被成功地商业化，包括质谱流式细胞术(mass cytometry)和基于微流控的方法。尽管流式细胞术提供了一个关于使用抗体检测单细胞中的蛋白质的极佳平台，但对于核酸的检测没有相当的解决方案。用于检测和定量单细胞中的mRNA的微流控技术极其昂贵，且它们的通量与使用流式细胞术对蛋白质可实现的相比低几个数量级。

为了克服大多数分析的限制，已经开发了测量单细胞中的基因表达的许多项技术。在一种这样的方法中，高达20个短寡核苷酸探针对在相邻位置中与靶RNA杂交。随后使用分支DNA技术扩增这些结合事件，其中在后续杂交步骤中的寡核苷酸组的添加产生了分支DNA分子。然后使用荧光探针，通过流式细胞术检测这种分支DNA结构的存在并定量。此技术使得能够检测数百万单细胞中的仅少量RNA拷贝数，但目前限于同时检测小数量的所测量的转录物。此外，该方案是长期和艰巨的，并且所用的缓冲液与流式细胞术中常用的一些荧光团不相容且根本不能在质谱流式细胞术中使用。

另一种方法(Larsson等人(2010)Nature Methods)使用挂锁探针，即线性探针，其可在与靶RNA分子杂交之后通过靶标依赖性连接转化为环状DNA分子。然后可在称为滚环扩增(RCA)的过程中使用酶phi29聚合酶扩增所生成的环化单链DNA探针。此过程产生含有原始DNA环的数百个互补串联重复的单链DNA分子。此RCA产物可通过添加荧光标记的检测探针而变得可见，所述检测探针将与产物中的检测序列杂交。此技术能够实现转录物的多重检测，但需要在挂锁探针的杂交之前使用特异性引物的靶mRNA的逆转录和原始转录物的RNA酶H消化。因此，它将额外的变异性引入测定中，且需要探针和引物的设计与优化。