[发明专利]生成无载体诱导多能干细胞的载体和方法

说明书

本发明主要涉及生成不含重编程载体的诱导多能干细胞(iPSC)的方法。在一些实施方式中，本发明涉及通过导入包括至少一个表达盒的附加型载体在体细胞中诱导多能性，所述表达盒含有重编程因子和/或合成转录因子和自杀基因。在一些实施方式中，本发明涉及通过导入包括表达盒的附加型载体在体细胞中诱导多能性，所述表达盒含有重编程因子和/或合成转录因子和转录调节EBNA‑1基因。在一些实施方式中，本发明涉及通过导入包括表达盒的附加型载体在体细胞中诱导多能性，所述表达盒含有重编程因子和/或合成转录因子以及自杀基因和转录调节EBNA‑1基因。

背景技术

发明领域

本发明主要涉及生成不含重编程载体的诱导多能(pluripotent)干细胞(iPSC)的方法。在一些实施方式中，本发明涉及通过导入包括至少一个表达盒的附加型(episomal)载体在体细胞中诱导多能性，所述表达盒含有重编程因子和/或合成转录因子和自杀基因。

背景技术

现今生成诱导多能干细胞(iPSC)的细胞重编程方法常常使用逆转录病毒来递送重编程因子。(Schlaeger等,非整合性重编程方法的比较(A comparison of non-integrating reprogramming methods),Nat Biotechnol 33(1):58-63(2015)(Schlaeger))。这些病毒的RNA被逆转录进DNA并且整合至宿主细胞的基因组中。然而，这类细胞并不适用于治疗性应用的规管准则。因此，需要其它重编程方法以保证iPSC不含任何外源性DNA序列。

如Schlaeger所总结，主要方法包括使用信使RNA转染(具有或不具有小-RNA)，以及基于附加体(EBNA-1)的表达载体。基于RNA的第一种方法可以高效生成iPSC，但是在劳动力需求和成功率(方法稳健性)以及细胞种类和供体特异性上有明显的问题。

考虑到方法所需的所有特征，附加型载体重编程存在令人兴奋的重编程“全方位(all-round)”系统。然而，由于载体保留延迟或整合至宿主细胞基因组，仍然存在的问题是在建立无外源性DNA系建立之前需要大量的传代。

当前使用附加型载体的细胞重编程方案需要进行定量测量以保证生成的iPSC系是无载体的。新生成的iPSC通常采集自转染后20-30天的P0平板。大多数集落在采集时仍然保留载体，并且不同的iPSC克隆中载体丧失动力学不同，一些集落被鉴定为以低传代(5-10)实现无载体，而另一些以高传代(15-30)实现无载体。这就使得必需从P0平板采集许多iPSC集落，并且长时间保持对它们的培养直到实现载体清除。该操作是细胞疗法应用的障碍，因为时间和成本是重要的因素。

发明内容

在一些实施方式中，本发明提供了生成基本上不含重编程载体的诱导人类多能干细胞(iPSC)的高效方法，其包括：(a)将重编程载体导入人类体细胞以生成第一细胞群，其中重编程载体包括病毒复制起点，编码至少一种iPSC重编程因子和/或合成转录因子的表达表达盒，和自杀基因；(b)培养第一细胞群以实现重编程因子和/或合成转录因子的表达，从而生成具有与胚胎干细胞一致性状的第二细胞群；以及(c)将所述第二细胞群与自杀基因底物接触以生成基本上不含重编程载体的细胞群。