[发明专利]多项扩增法

权利要求书

1.一种方法，该方法使用由包含至少1对以上的包含正向引物(a)和反向引物(b)的引物对的引物对组X、包含正向引物(c)和反向引物(d)的引物对Y、以及包含正向引物(e)和反向引物(f)的引物对Z构成的引物组，同时地扩增多个目标核酸组，

所述正向引物(a)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列A的全部或3’末端侧的一部分序列，所述反向引物(b)在3’末端侧具有与目标核酸互补的序列，在其上游侧具有人工核酸序列B的全部或3’末端侧的一部分序列，

所述正向引物(c)在3’末端侧具有人工核酸序列A，在5’末端侧具有人工核酸序列C，所述反向引物(d)在3’末端侧具有人工核酸序列B，在5’末端侧具有人工核酸序列D，

所述正向引物(e)具有人工核酸序列C的全部或一部分序列，所述反向引物(f)具有人工核酸序列D的全部或一部分序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述引物对Y的正向引物(c)和反向引物(d)分别在人工核酸序列C、D的3’末端与人工核酸序列A、B的5’末端之间具有用于识别样品的人工核酸序列，即以下的条形码序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

最先将所述的引物对组X及引物对Y、Z全都混合，不进行中途的纯化、稀释地利用一连串的反应完成所述扩增。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对Z以所述引物对Y的浓度的至少3倍存在。

5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对Y以不产生来自于它的引物二聚体的浓度存在，并且所述引物对Z以足以获得目的产物的浓度存在。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，

所述引物对组X包含至少5对引物。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，

所述引物对组X包含至少20对引物。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，所述引物对组X中的各引物对以1nM～20nM的范围存在。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，

在试样溶液中，通过调整所述引物对组X中的各引物对的浓度，可以使各目标基因的扩增效率接近均匀。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，

所述扩增是PCR法、LAMP法、NASBA法、ICAN法、LCR法、滚环法SMAP法、PALSAR法的任意1种。

11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，

进行2个循环以上的利用所述引物对组X的扩增，进行20个循环以上的利用所述引物对Y、Z的扩增。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，

使用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行所述扩增。