[发明专利]纯化泊洛沙姆的方法

说明书

本发明涉及用作细胞培养基添加剂的泊洛沙姆的纯化。活性碳可用于去除降低泊洛沙姆作为细胞培养添加剂的功效的疏水性高分子量组分。

本发明涉及用作细胞培养基添加剂的泊洛沙姆的纯化。活性碳可用于去除降低泊洛沙姆作为细胞培养添加剂的功效的疏水性高分子量组分。

发明背景

泊洛沙姆，特别是泊洛沙姆188，用于许多工业应用、化妆品和药品中。它们还用于细胞培养基过程。向细胞培养基中添加泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆188显著改善了细胞活力。高细胞活力对于最佳蛋白质生产至关重要。泊洛沙姆改善细胞活力的原因尚未完全理解。据信泊洛沙姆降低剪切应力，以此方式保护细胞免受损伤。作为非离子表面活性剂的泊洛沙姆可能在气泡/培养基界面浓缩，并可防止细胞附着于气泡，以此方式防止在气泡破裂时细胞损伤。它也可以减少当气泡破裂时的冲击。一些出版物声称泊洛沙姆改善从气体到液相中的氧气转移速率，但其他出版物与这些发现相矛盾。还有指出泊洛沙姆可以“修复”细胞膜中的小缺陷。

当在细胞培养基中使用时，在商业上可获得的泊洛沙姆如泊洛沙姆188批次中观察到显著的批次间变异性。因此，一些批次不适合用于细胞培养，因为它们并不充分保护细胞免受损伤/死亡。其原因尚不完全理解。因此，当使用不良批次时，细胞活力显著较低。

另外对于其他应用，泊洛沙姆有时需要纯化。已经提出了几种纯化泊洛沙姆的方法。

WO12091361中，有机金属杂质被鉴定并使用活性碳从泊洛沙姆批次中除去。据称有机金属杂质的去除对于通过链延长合成多嵌段共聚物以用作药物递送系统而言是必需的。

在WO2002014380中，通过分馏纯化泊洛沙姆。较低分子量组分(例如单和二嵌段组分)被鉴定为有害的并且通过水性两相萃取方法除去。

在WO2015148736中，描述了改善泊洛沙姆在细胞培养中的性能的方法，尤其是对于性能差的批次。确定温度处理改善性能差的批次的性能。没有得出明确的结论关于为什么温度处理改善该批次或者可以消除哪些杂质。

WO2014194137描述了评估细胞培养添加剂如泊洛沙姆188的批次性能的方法。在这些添加剂中存在或不存在高分子量组分和/或高疏水性组分指示添加剂用于防止细胞剪切损伤的功效。

尽管如此，仍然不确定哪些批次泊洛沙姆在细胞培养中不能充分保护细胞，更进一步地，那些性能差的批次能够如何处理以将它们变成性能好的批次。

已经发现，通过用活性碳处理可以提高性能差的泊洛沙姆批次的性能。进一步发现，该处理减少了那些批次中高分子量疏水性化合物的量。添加的活性碳越多，去除的高分子量组分越多(参见SEC数据)，在细胞培养中的性能越好(参见细胞培养中的活力增加)。

因此，本发明涉及增加泊洛沙姆在细胞培养中增加细胞活力的功效的方法，该方法通过以下方式进行：

a)提供其功效要被改善的泊洛沙姆

b)将步骤a)的泊洛沙姆溶解在溶剂中并使它们与活性碳接触

c)除去活性碳和溶剂以获得具有改善功效的泊洛沙姆。

对于本领域技术人员显而易见的是，不能进一步改善显示最佳功效的批次。其功效要被改善的泊洛沙姆是其在细胞培养中增加细胞活力的功效低于其他泊洛沙姆批次功效的那些泊洛沙姆。这可以例如在细胞活力测定中测试。实施例6中提供了合适的测定及其应用的实例。

在优选的实施方案中，溶剂是水、丙酮、THF或乙醇和水的混合物。

在另一个优选的实施方案中，溶解的泊洛沙姆与活性碳接触1分钟至24小时，这取决于是以流通方式进行还是分批进行。

在另一个优选的实施方案中，在步骤c)中，通过离心和/或过滤除去活性碳。