[发明专利]带电质量标记系统

说明书

本发明大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。在某些方面，本发明提供带电质量标记组合物，其包括亲和试剂以及与亲和试剂结合的质量标记前体。质量标记前体包括标记结合单元和质量标记。标记结合单元可逆地将质量标记与亲和试剂结合。质量标记包括电荷单元和在质谱中具有预定义的质荷比值的质量标记单元。

相关申请

本申请要求2016年1月22日提交的美国临时专利申请序列号62/286,115的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明大体上涉及带电质量标记组合物及其用于检测样品中的靶标分析物的使用方法。

背景技术

已经开发了一些测定法，其重点在于从体液中分析稀有分子(例如蛋白质，核酸等)是否存在异常，从而导致某些病况如癌症的早期诊断。然而，在典型的体液样品中，大多数稀有分子被降解，并且相对于样品中分子的总量，任何含有所关注的异常的改变的稀有分子以少量(例如，小于1％)存在。这导致无法检测到少量异常稀有分子。

已经开发了亲和力测定法、核酸测定法和细胞分析测定法用于检测样品中的稀有分子。每个都有一些缺点。例如，通过常规亲和力测定法无法检测到每毫升1至50,000个拷贝(飞摩尔(fM)或更低)的稀有分子，常规亲和力测定法需要远远超过稀有分子数量的分子拷贝数。免疫测定法受抗体的亲和力结合常数的限制，所述亲和力结合常数通常不高于10^-12(1pM)。由于解离速率为10^-13，所以免疫测定法需要至少100倍的抗体过量，并且抗体蛋白的溶解度限制了反应的完成。

针对核酸，先前已经采用基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、数字PCR、定量PCR)来试图检测这些异常。然而，由于扩增反应的随机性质，所以通常忽略样品中少量存在的分子群。事实上，如果稀有核酸在前几轮扩增中没有被扩增，那么稀有物种将越来越不可能被检测到。

在稀有分子被细胞结合或包含在细胞内的情况下，采用细胞分析技术，需要分离包含稀有分子的靶细胞。包含稀有分子的那些细胞通常仅代表分析中的一小部分样品。因此，即使在检测这些细胞内的稀有分子之前，也需要具有高分离效率和细胞回收率的方法。纯化后，可以通过常规扫描显微镜将稀有细胞分析至单细胞水平。然而，即使扫描和分析自动化，对于每个待扫描的样品，显微镜方法可能需要24小时或更长时间。另外，所有具有多个图像的稀有细胞必须由病理学家目测检查以确定测量的蛋白质量的显著性。

已经尝试使用质谱法(MS)进行稀有事件检测。但是，出现了一些问题。例如，不能将所关注的标记与样品干扰(矩阵重叠)分开。由于临床样品中的背景而导致的更高检测极限(皮摩尔(pM)增加至纳摩尔(nM))是一个问题。由于小于1微升(jal)的样品被低效捕获用于电离并且从复杂样品例如血液中低效地分离，因此无法使用小的nL样品体积。此外，由于与相同质量的其它离子竞争电离或由于特定基质组分的存在而抑制电离，所以MS通常不能检测到某些质量。这些问题通常会由于假阳性和/或假阴性结果而导致问题。

为了解决这些问题，已经开发了依赖于使用与样品中的稀有分子结合的质量标记的技术。该方法允许质谱法用于稀有事件检测，因为使用质量标记克服了与直接检测样品中的稀有分子相关的上述问题。

然而，质量标记仍然存在问题，其限制了质谱法用于稀有分子检测的全部潜力。例如，目前的MS标记通常利用通过可逆二硫键与亲和剂结合的肽。然而，肽倾向于在质谱仪中容易地交换质子并且通常具有低电离效率。另外，用于从二硫键释放肽的化学物质，例如TCEP和DTT，可能抑制来自质量标记的质谱中的信号强度。虽然强酸例如TFA可以提高电离效率，但它们防止TCEP和DTT裂解二硫键，因此需要单独的液体来通过喷雾电离释放和电离质量标记。