[发明专利]蛋白质纯化

说明书

本发明涉及一种纯化蛋白质的方法，包括半连续色谱步骤，由此收集流出物并将其重新装载到色谱基质上。

发明领域：

本发明属于蛋白质纯化领域。更具体地，本发明涉及使用半连续色谱步骤，纯化目标蛋白质如抗体或抗体片段的方法。

发明背景：

蛋白质的大规模经济纯化越来越成为生物技术产业的重要问题。通常，蛋白质通过细胞培养生产，其中通过插入含有该蛋白质基因的重组质粒，使用经过工程改造的哺乳动物或细菌细胞系来生产目标蛋白质。由于所使用的细胞系是活生物体，因此必须喂养含有糖、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基。目标蛋白质必须从供给细胞的化合物混合物和从细胞本身的副产物(进料流)中分离到足以用作人治疗剂的纯度。卫生当局为用于人类施用的蛋白质设定的关于来自进料流的杂质的标准非常高。本领域已知的许多蛋白质纯化方法包含需要应用例如低pH或高pH、高盐浓度或其他可能不可逆地危害待纯化蛋白质的生物活性的极端条件的步骤，从而不合适。因此，将所需蛋白质分离至足够的纯度构成了艰巨的挑战。历史上，蛋白质纯化方案已经基于待纯化蛋白质和不需要的蛋白质污染物之间的大小、电荷和溶解度的分子性质的差异进行预期。基于这些参数的方案包括尺寸排阻色谱、离子交换色谱、差异沉淀等。

抗体和抗体片段在一系列治疗领域中变得越来越重要。产生抗体和抗体片段的最重要方法之一是通过重组技术。这些技术使用宿主细胞来表达所需的抗体或，然后将其从生产培养基中分离并纯化。

抗体需要糖基化，并因此通常在使用真核细胞的真核表达系统中表达，特别是哺乳动物细胞如CHO、PER.C6、NS0、BHK或Sp2/0细胞。在真核表达系统中，表达的目标蛋白质如抗体通常被分泌到细胞培养基中。随后可以容易地将培养基与分泌蛋白质的细胞分离，例如，通过离心或过滤。

几乎所有目前的工业抗体纯化平台都使用蛋白A。蛋白A是在细菌金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的细胞表面蛋白，其与哺乳动物免疫球蛋白的Fc部分结合。蛋白A对人IgG₁和IgG₂抗体具有高亲和力，对人IgM、IgA和IgE抗体具有中等亲和力。因此，蛋白A纯化不适用于缺乏Fc部分的抗体片段。

亲和色谱基于目标蛋白质(或一组蛋白质)与偶联于色谱基质的特定配体之间的可逆相互作用来分离蛋白质。目标蛋白质和偶联于色谱基质的配体之间的相互作用可以是静电或疏水相互作用、范德华力和/或氢键合的结果。为了从亲和介质中洗脱靶分子，可以逆转相互作用，例如通过使用竞争性配体特异性地进行，或通过改变pH、离子强度或极性而非特异性地进行。亲和纯化需要可以共价连接到色谱基质上的配体。偶联的配体必须保持其对靶分子的特异性结合亲和力，并且在洗去未结合的物质后，配体和靶分子之间的结合必须是可逆的，以允许靶分子以活性形式被取出。尽管其常用，但亲和色谱是昂贵的，特别是在纯化治疗性蛋白质所必需的工业规模上。