[发明专利]富含营养的萌发剂组合物及孢子培养方法

说明书

一种有助于孢子萌发的营养萌发剂组合物和一种提高孢子萌发效率的方法。组合物包含L‑氨基酸、D‑葡萄糖和/或D‑果糖、磷酸盐缓冲液、工业防腐剂，并且可以包括细菌孢子，或者它们可以单独组合用于萌发。方法包括提供营养萌发剂组合物和细菌孢子，优选地一种或多种芽孢杆菌属物种，并加热至41℃至44℃的优选升高的温度范围培养时间为约2至60分钟。营养萌发剂组合物优选为浓缩液体形式，其在即将开始萌发/培养方法之前在使用点被稀释。方法还可包括将萌发的孢子溶液分配到使用点/消耗点，例如动物饲料、水或垫料、或废水系统或排水管。

相关申请的引证

本申请要求2016年4月5日提交的美国临时专利申请号62/318,587的权益。

1.技术领域

本发明涉及营养-萌发剂(germinant)浓缩物组合物(成分，composition)和萌发(发芽，萌芽，有发芽能力，germinating)细菌孢子的使用点(point-of-use)培养(孵化，温育，incubation)方法。

2.背景技术

孢子萌发是一种多步骤的致病过程，其中孢子有效地唤醒或从休眠状态恢复到营养生长状态。第一步骤是激活孢子并通常通过称为萌发的环境信号诱导其萌发的步骤。该信号可以是诸如L-氨基酸的营养物。营养萌发剂与孢子内膜中的受体结合以启动萌发。此外，糖已被证明增加L-氨基酸对其同源受体的结合亲和力。

然后，萌发信号启动引起吡啶二羧酸(DPA)的释放的级联，其与孢子核中的Ca²⁺(CaDPA)以1:1的比例储存。CaDPA的释放是一个快速的过程，且通常在2分钟内完成90％。CaDPA释放代表了其中它们致力于萌发过程的孢子的不归点(point of no return)。本领域技术人员将该步骤称为“定型(commitment)”步骤。

CaDPA释放后，孢子部分水合，且核的pH升至约8.0。然后，孢子的核膨胀，且皮层(主要由肽聚糖组成)被核裂解酶降解。孢子吸收水分，因此失去其折射率。在萌发过程结束时这种折射率的失去允许通过相差显微镜监测孢子萌发。

萌发的第二阶段是其中孢子的代谢、生物合成和DNA复制/修复途径开始的自然的发展步骤(外生长步骤，outgrowth step)。自然的发展期有几个阶段。第一种被称为成熟期，其中不发生形态变化(例如，细胞生长)，但孢子的分子机制(例如，转录因子、翻译机制、生物合成机制等)被激活。该期间的长度可以根据孢子形成过程期间使用孢子包装的初始资源而变化。例如，几种芽孢杆菌属物种(芽孢杆菌物种，Bacillus species)(包括枯草芽孢杆菌)的优选碳源是苹果酸，且芽孢杆菌孢子通常含有在复苏过程中使用的大量苹果酸。有趣的是，与野生型孢子相比，不能利用苹果酸池的缺失突变体显示出延长的成熟期，表明孢子苹果酸池足以激发初始的自然发展过程。此外，孢子储存小的酸溶性蛋白质，酸溶性蛋白质在复苏的前几分钟内降解充当蛋白质合成的直接氨基酸来源。在自然的发展步骤之后，孢子复苏完成并且细胞被认为是无性生长的。

已知可以通过热激活诱导孢子萌发。各种芽孢杆菌属物种的孢子在菌株特异性温度下被热激活。例如，枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)孢子在75℃下热激活30分钟，而地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)孢子在65℃下热激活20分钟。已显示热激活引起孢子外壳蛋白的瞬时、可逆展开。然后，可在含有营养萌发剂(例如，L-丙氨酸)的萌发缓冲液中将热激活的孢子萌发另外的时间。然而，如果不存在营养萌发剂，则孢子将返回其预热的非萌发状态。

还已知萌发可以在没有热激活但存在含有营养物的萌发缓冲液的情况下在环境温度(接近典型的室温)下发生，但该过程通常比热激活需要更长的时间。例如，地衣芽孢杆菌孢子和枯草芽孢杆菌孢子将分别在35℃或37℃下萌发，但在含有营养萌发剂的萌发缓冲液中其需要更长的时间(例如，2小时)。此外，已知枯草芽孢杆菌的非热激活孢子已在非营养萌发剂条件(例如，CaCl₂+Na₂DPA)中萌发延长的一段时间。