[发明专利]产多巴胺神经祖细胞的制备方法

说明书

本发明通过下述步骤(1)及(2)制备包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体，并使用与Corin结合的物质和/或与Lrtm1结合的物质从得到的细胞群体中收集Corin和/或Lrtm1阳性细胞，通过将该Corin和/或Lrtm1阳性细胞在包含1个或多个神经营养因子的培养液中悬浮培养，从而制备产多巴胺神经祖细胞。(1)将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含Sonic hedgehog(SHH)信号刺激剂及未分化维持因子的未分化维持培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，及(2)将步骤(1)中得到的细胞群体在包含1种以上的诱导分化因子的培养液中培养的步骤。

技术领域

本发明涉及产多巴胺神经祖细胞的制备方法、以及包含可使其向产多巴胺神经祖细胞分化的Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法。

背景技术

帕金森氏病是由于中脑黑质的产生多巴胺的神经细胞的脱落而发生的神经变性疾病，目前全世界约有400万患者。作为帕金森氏病的治疗，已经进行了基于L-DOPA或多巴胺激动剂的药物治疗、基于定位脑手术的凝固术或深层电刺激治疗及胎儿中脑移植等。

胎儿中脑移植存在其供应源的组织的伦理问题，并且感染的危险性也高。因此，提出了使用从胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞所诱导分化成的神经细胞的治疗法(非专利文献1)。但是已有人指出，经诱导分化的神经细胞在移植时有可能形成良性肿瘤，而且认为产多巴胺神经细胞以外的细胞可能导致运动障碍，因此，人们追求选择植活并且安全的细胞进行移植。

作为产多巴胺神经祖细胞的制备方法，提出了包括通过作为产生多巴胺的神经细胞或产多巴胺神经祖细胞的标记的基因而筛选适于移植的细胞的步骤的方法(专利文献1)，但为了减少由含有生物来源成分所导致的批次差异的影响、提高产生效率，进一步的改良是人们希望的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/34012号公报

非专利文献

Wernig M,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A,2008,引物105:5856-5861

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于制备适于作为帕金森氏病治疗剂的产多巴胺神经祖细胞。因此，本发明的问题是提供产多巴胺神经祖细胞的制备方法等。

解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题进问题研究，着眼于细胞表面膜蛋白Corin和/或Lrtm1，发现了可高效制备包含表达它们的细胞的细胞群体的方法。进而发现，以Corin和/或Lrtm1为指标从该细胞群体中提取细胞，进一步继续培养后，可得到产多巴胺神经祖细胞，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]包含Corin和/或Lrtm1阳性细胞的细胞群体的制备方法，包括下述步骤(1)及(2)：

(1)将多能干细胞在无饲养层细胞存在下，在包含Sonic hedgehog(SHH)信号刺激剂及未分化维持因子的未分化维持培养基中，在细胞外基质的存在下进行贴壁培养的步骤，及

(2)将步骤(1)中得到的细胞在包含1种以上的诱导分化因子的培养基中培养的步骤。

[2]根据[1]所述的制备方法，其中，SHH信号刺激剂为SAG(N-甲基-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)、shh蛋白质或其片段、Purmorphamine或它们的组合。