[发明专利]从基因工程微生物改进的黏康酸生产

说明书

本发明的主题是通过发酵改善黏康酸的生物生产的产率和滴度。参与黏康酸途径的一种或多种酶的增加的活性导致黏康酸的增加的产生。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年3月2日提交的美国临时申请序列号62/302,558的优先权。

发明领域

本发明涉及使用在中心芳香族生物合成途径中进行基因工程改造的生物催化剂生产可再生化学原料的领域。更具体地，本发明提供了使用遗传修饰的生物催化剂改善从可再生碳源生产黏康酸的方法。

背景技术

己二酸是主要的商品化学品，用于生产尼龙6,6和聚氨酯。己二酸目前衍生自石化原料。目前己二酸的合成对环境有害，释放出亚硝酸(Xie等，2014)。或者，己二酸可以通过化学氢化由黏康酸的三种异构体(顺式,顺式；顺式，反式；反式，反式异构体)中的任何一种制成。希望通过用微生物发酵从可再生资源中生产黏康酸，然后通过氢化过程产生己二酸，因为这种产生己二酸的途径比传统的石化途径更环保(Niu，Draths and Frost，2002；Frost and Draths，1997)。许多其他化学品可以通过一种或多种黏康酸异构体的化学转化来制备，包括但不限于1,6己二醇、3-己烯二甲酸、1,6-己二胺和对苯二甲酸。

国际专利申请公开号WO 2011/017560要求保护具有黏康酸途径的生物催化剂和利用这些生物催化剂来生产黏康酸的方法。简而言之，这件公开的专利申请公开了四种不同的生产黏康酸的途径。第一种用于黏康酸生产的途径以琥珀酰-CoA和乙酰-CoA起始。第二种用于黏康酸生产的途径以丙酮酸和丙二酸半醛起始。第三种用于黏康酸生产的途径以丙酮酸和琥珀酸半醛起始。第四种用于黏康酸生产的途径以赖氨酸起始。在此专利申请中提出的所有这些用于黏康酸生产的途径都是基于计算机建模，而这些生物催化剂究竟能否产生为具备商业上可接受的黏康酸生产力和产率还有待观察。

在科学文献(Niu等人，2002；Frost and Draths，1997)和专利文献(US 5,487,987；US 5,616,496；WO 2011/085311 A1)中描述了使用基因工程大肠杆菌系统生产顺式,顺式-黏康酸的发酵途径。然而，用于黏康酸生产的现有技术方法具有显著的缺点，例如昂贵的培养基组分(芳香族氨基酸和维生素)和化学诱导剂，以及低于工业生产所需的产率。最近的美国专利申请公开号US2015/0044755(其全部内容通过引用并入本文)提供了用于黏康酸生产的改进的生物催化剂，涉及相关基因的组成型表达、改进的异源基因和新的“渗漏”AroE酶。本发明提供了美国专利申请公开号US2015/0044755中描述的黏康酸生物催化剂的进一步改进。

发明概述

本发明提供从非芳香族碳源开始生产顺式,顺式-黏康酸的基因改造的微生物，非芳香族碳源如,糖和碳水化合物，包括但不限于葡萄糖，蔗糖，甘油和纤维素水解产物。

在本发明的一个实施方案中，芳香族氨基酸生物合成的负调节物的活性受基因操纵。在本发明的一个方面，负调节物TyrR的活性通过控制编码TyrR蛋白的tyrR基因的表达而实质降低。在本发明的另一方面，负调节物TyrR的活性通过将来自微生物的染色体DNA的tyrR基因缺失或失活而完全消除。