[发明专利]生物样品中磷酸化和非磷化形式的RKIP的定量评估方法

说明书

本发明涉及用于生物样品中RKIP蛋白和p‑RKIP蛋白的定量测量的方法。本发明提供了一种用于测量生物样品中磷酸化和非磷酸化形式的RKIP蛋白的定量方法。本发明还提供了一种新的ELISA测试，其特异于生物样品中非磷酸化(RKIP)和磷酸化形式(p‑RKIP)的RKIP定量配量，以获得每种形式的定量测量和它们之间的比例。在具有相同的性能下，本发明所提出的方法比现有的解决方案更方便和更有效。

本发明涉及在尿液或其他生物样品中对磷酸化和非磷酸化形式的被称为RAF激酶抑制剂(RKIP)的蛋白进行单一或组合定量评估的方法。

发明领域

基因组学、蛋白质组学和分子病理学的进步已经产生了许多具有潜在临床价值的生物标记候选物，然而这些没有被更多地常规使用，主要是因为学术研究和生物技术产业研究之间的方法和观点的强烈分离，这限制了它们的协作。

通过pubmed搜索引擎对主要生物体液中描述的生物标记物与市场上现有的测试进行比较分析，可以了解潜在生物标记物的数量与其已开发的投入市场的测试之间存在巨大的差异。通过输入关键词，如生物标记物和血清，有超过一百篇出版物出现在pubmed中，其中超过7000篇是综述。对于尿液也是如此，其在超过21000篇出版物中被描述为用于研究泌尿生殖系统病理生物标记物的理想生物流体，其中约有2800篇是综述。文献中描述的大部分血清和尿液生物标记物具有蛋白质性质(其中关于血清的有超过75000篇原始工作和5000篇综述和关于尿液的有约10000篇原始工作和1400篇综述)。如果仅考虑与癌症相关的血清和尿液生物标记物，则原始科学工作的数量减少至关于血清生物标记物的有约30000篇和关于尿液的有约4500篇。即使这些数字必须被粗略地考虑，因为很明显，对于一些研究较多的生物标记物，有数百篇出版物描述了它们在各个领域中的应用和不同的目的，但令人惊讶的是目前市场上只有100种涉及同样多的肿瘤生物标记物的ELISA测试被批准用于各种肿瘤的诊断、预后和/或预测用途。

最近Powers等人已经强调，与DNA和转录物相比，蛋白质现在仍然代表能够更准确地描述个体的健康和/或病理表型的分子，因为它们是调节细胞过程的最终效应物。

特别地，最近的文献报告了在肿瘤标记物中Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的更重要的作用。RKIP在发育年龄期间在许多组织(尤其是睾丸、脑、附睾、肝和肾)中广泛表达。RKIP已被描述为与许多肿瘤相关并且已经被介绍为新一类蛋白质，即转移抑制子，因为其下调通常与转移的主要风险相关。

RKIP减少已在几乎所有肿瘤中被描述，特别是它在前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、黑素瘤、胰岛素瘤、肝细胞癌、间变性甲状腺癌和肾细胞癌中与中长期存活相关并且与复发相关。因此，RKIP被认为是这样的预后生物标记物，其表达水平越低，肿瘤越具攻击性和侵袭性。RKIP能够以非磷酸化的、游离形式或磷酸化形式(其介导其二聚化并还改变其细胞内分子靶标)存在。最近，许多研究人员的注意力转移到RKIP磷酸化形式(p-RKIP)，在某些情况下，其显示出比RKIP非磷酸化形式更高的预后能力。已经对于肺癌、乳腺癌、黑素瘤以及最近对于鼻咽癌描述了这种作用。

到目前为止，产生的研究主要集中在通过主要使用免疫组织化学技术对RKIP和p-RKIP表达水平进行组织评估。即使该技术代表分子诊断中最普及的分析之一，但它也具有一些重要的限制，例如需要通过侵入性分析(例如活组织检查)获得组织，并且通常由于结果的主观解释而具有半定量值，其确定中心之间的变异性。由于对于这项技术而言，即使在全世界的临床中心被广泛接受，仍然需要标准化用于样品制备、分析执行和结果解释的程序，因此显然RKIP和p-RKIP定量配量需要到目前为止尚未提供的不同方法。

ELISA技术(酶联免疫测定)是一种免疫学分析方法，在生物化学中广泛用于通过使用一种或多种抗体检测底物的存在，所述一种或多种抗体中的一种上结合了酶：这种分析方法属于免疫酶学测试并且主要用于免疫学以检测和/或定量样品中蛋白质、抗体或抗原的存在。