[发明专利]用于评估和确定抗菌多肽的最小抑制浓度的肉汤微量稀释法

说明书

本发明提供了用于评估抗菌效力和确定杀灭细菌的多肽(包括溶素多肽)的最小抑制浓度(MIC)的组分、测定和方法。提供了改良的肉汤微量稀释组分和方法，包括补充剂以使得模拟人基质(包括血清和血液)中的溶素多肽活性的精确MIC测定成为可能。

技术领域

本发明一般涉及用于评估抗菌效力和确定杀灭细菌的多肽(包括溶素多肽)的最小抑制浓度(MIC)的组分、测定和方法。

背景技术

耐药细菌的发展是医疗中的主要问题，因为更多的抗生素用于广泛的疾病和其他状况。新型抗微生物治疗方法包括基于酶的抗生素(“酶抗生素(enzybiotics)”)，例如噬菌体溶素。噬菌体使用这些溶素消化其细菌宿主的细胞壁，通过低渗裂解释放病毒后代。溶素对革兰氏阳性病原体的高致死活性使其成为作为治疗剂开发的有吸引力的候选者(Fischetti,V.A.(2008)Curr Opinion Microbiol 11:393-400；Nelson,D.L.等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。最初提出噬菌体溶素是用于根除病原性链球菌的鼻咽携带(Loeffler,J.M.等(2001)Science 294:2170-2172；Nelson,D.et al(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:4107-4112)。

已建立噬菌体裂解酶作为可用于通过各种给药途径评估和特异性治疗受试者中各种类型的感染。例如，美国专利5,604,109(Fischetti等)涉及通过半纯化的C组链球菌噬菌体相关的溶素酶的酶促消化来快速检测临床标本中的A组链球菌。这种酶作用成为进一步研究的基础，导致治疗疾病的方法。Fischetti和Loomis的专利(美国专利5,985,271，6,017,528和6,056,955)公开了由C1噬菌体感染的C组链球菌细菌产生的溶素酶的用途。美国专利6,248,324(Fischetti和Loomis)公开了用于皮肤病学感染的组合物，其通过在适于局部施用于真皮组织的载体中使用裂解酶。美国专利6,254,866(Fischetti和Loomis)公开了治疗消化道细菌感染的方法，其包括施用对感染细菌具有特异性的裂解酶。美国专利6,264,945(Fischetti和Loomis)公开了通过肠胃外引入(肌肉内、皮下或静脉内)至少一种裂解酶和用于将裂解酶递送至患者的合适载体来治疗细菌感染的方法和组合物，所述裂解酶由被对该细菌具有特异性的噬菌体感染的细菌产生。

美国专利7,402,309，7,638,600和已公布PCT申请WO2008/018854提供了不同的噬菌体相关裂解酶，其可用作治疗或减少炭疽杆菌感染的抗菌剂。美国专利7,569,223描述了用于肺炎链球菌的裂解酶。可用于肠球菌(粪肠球菌和屎肠球菌，包括耐万古霉素菌株)的溶素描述于美国专利7,582291中。US2008/0221035描述了高效杀灭B组链球菌的突变PlyGBS溶素。在WO2010/002959中详述了称为ClyS的嵌合溶素，其具有针对葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌)的活性。在WO2012/145630和美国专利9,034,322中描述了从猪链球菌分离并有效杀灭链球菌、葡萄球菌、肠球菌和李斯特菌菌株的PlySs2溶素。

PlySs2溶素(CF-301)是第一个进入并完成FDA允许的I期临床试验的溶素。该溶素可与标准治疗抗生素(例如，万古霉素或达托霉素)组合以治疗由甲氧西林敏感和耐药的金黄色葡萄球菌引起的血流感染，包括心内膜炎。为了支持临床试验，体外抗生素易感性测试(AST)用于评估和标准化细菌试剂。

肉汤微量稀释(BMD)可用于测试溶素，例如针对金黄色葡萄球菌分离物的PlySs2/CF-301活性，然而标准方法(CLSI方法)不是可靠的测定法，并且当应用于溶素多肽例如PlySs2(CF-301)时表现出各种问题。这些问题包括拖尾效应，人体血液、血清或血浆中易感性发现的脱节或变化，以及冷冻药物稀释组中酶活性的丧失。