[发明专利]制剂

说明书

本发明涉及一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成(成核)的制剂，其包含能够用作冰成核剂的框架硅酸盐矿物和铵盐。

本发明涉及一种在含水量的生物实体的冻结处理过程中促进冰的非自发形成(成核)的制剂，并且涉及其在含水量的生物实体的冻结处理中的用途。

生物材料的保存有两个相关的过程。在冷冻保存中，生物材料被冻结并以冻结状态贮存。在冻结干燥(冻干)中，水从冻结的生物样品中去除，然后以干燥状态贮存。

冷冻保存被广泛用来维持用于医学、生物技术和兽医科学的生物样品的长期活力。为了在解冻后获得高活力，有必要添加保护性化合物(称为防冷冻添加剂或防冻剂)并以受控的速度冷却样品。对于许多细胞类型，有必要通过受控的成核来诱导冰的形成，而不是允许在不受控制的过饱和下自发冰成核。

用于冷冻保存的样品一般放在专门的冷冻容器中，例如以下容器：

•吸管，其为直径2-4 mm，长度至多140 mm，容量0.2 ml-0.5 ml的薄壁管；

•冷冻瓶，其为约12.5 mm直径和0.5 ml-5.0 ml容量的宽短管；

•软袋，其容量为5 ml-1000 ml，用于较大体积的冷冻保存；和

•微量滴定板、矩阵管和其它SBS格式，用于机器人学和高通量筛选。

一系列设备可用于以受控的速度冻结吸管和冷冻瓶。这些可以使用液氮作为冷冻剂，或者通过机械制冷来冷却。此外，存在许多被动冷却装置。这些装置中的一些允许样品内的冰的受控成核，其可手动或自动执行。

在以受控的速度冻结后，样品在低温(通常为液氮的温度(-196℃))下保持冻结。在该温度下，如果细胞在冷却中存活，其活力与储存时间无关。当需要使用时，将样品快速解冻(一般在维持于37℃的水浴中)并除去防冻剂。

冻结干燥(冻干)被广泛应用于生物技术、医学和兽医科学，用于细胞、疫苗、蛋白质和其它生物活性化合物的长期稳定。冻结干燥也用来生成结构化材料，例如应用于再生医学和新型陶瓷生产的支架和基质。在冻结干燥过程中，将含水样品放在专门的容器(通常为玻璃小瓶)中并在冻结干燥机的冷却架上冻结。冻结后，局部气体压力降低，冻结样品内的冰升华。从样品中除去水后，在真空下温热小瓶并密封。样品可在环境温度下分配，并通过加水而重构。

对于冷冻保存样品的受控冰成核，已检查了许多冰成核剂(有时称为冰成核剂(nucleator)、冰成核催化剂、冰成核粒子或冰核)。这些冰成核剂促进了一种称为异质成核的现象。实例包括碘化银晶体、细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、胆固醇晶体和框架硅酸盐类的矿物(见例如WO-A-2014/091216)。将冰成核剂加入样品，所述样品然后冷却。当样品内达到足够水平的过度冷却时，冰成核发生。Zimmerman et al J. Geophys.Res. Atmos., 2008, 113, D23204的一项调查通过长石的冰成核的之前研究已经证明，它们在对于含水量的生物实体的冻结处理足够温暖的温度下不有效地使冰成核。Nedava et al SELSKOKHOZYAISTVENNAYA BIOLOGIYA (Agricultural Biology), 1992, No. 4, 20-24描述了向公羊精子的悬浮液中加入细碎的硅石，旨在改善冷冻生物学程序过程中的结果。这样做是为了稳定精子细胞的膜，而不是诱导成核。