[发明专利]耻垢分枝杆菌的遗传修饰株

说明书

本发明涉及基于非病原性细菌的重组细菌，所述细菌具有含有通过分子诊断测定检测的来自病原体的目的核酸的修饰的基因组并且模拟所述病原体的诊断特征。本发明还涉及包含所述重组细菌的诊断对照组合物和用于产生所述重组细菌的方法。所述重组细菌是用于检测病原体如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的安全，可靠的质量对照。本发明还涉及试剂盒，其包含所述重组细菌，含有所述重组细菌的组合物或根据本发明方法制备的细菌。

发明背景

本发明涉及基于非病原性细菌的重组细菌，所述细菌具有含有通过分子诊断测定检测的来自病原体的目的核酸的修饰的基因组并且模拟所述病原体的诊断特征。本发明还涉及包含该重组细菌的诊断对照组合物和用于产生该重组细菌的方法。所述重组细菌是检测病原体如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的安全，可靠的质量对照。

结核病(TB)是一种毁灭性疾病，难以有效进行临床管理。其强大的性质与过时的诊断方法使得在护理点的治疗越来越困难，特别是在耐药菌株的不断增加的流行中。随着许多微生物疾病的诊断从细菌培养和显微鉴定方法转向分子生物系统，自动化需要严格的校准以确保结果的灵敏度和特异性。世界卫生组织(WHO)已批准两项核苷酸扩增测定(NAA)诊断测试（即MTB/RIF(Cepheid Innovation)和GenoType MDRTBplus LineProbe Assay(LPA)(Hain))，用于肺病患者中结核分枝杆菌的标准鉴定，其可同时鉴定该生物体以及评估RIF和/或INH抗性。这使临床医生能够为患者量身定制药物治疗方案，从而不仅可以改善治疗效果，还可以限制社区的传播。在这里，我们报告相关的非病原性上壤细菌耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的修饰菌株，其在MTB/RIF(MTB/RIF)和LPA中关于生物鉴定和RIF抗性分析方面模拟H₃₇Rv的诊断特征(diagnostic profile)。为了将这种方法扩展到其他疾病，我们还证明，可以将金黄色葡萄球菌基因序列引入耻垢分枝杆菌，以在设计用于鉴定金黄色葡萄球菌中的甲氧西林(methicillin)抗性的SA Nasal complete盒中产生阳性反应。该发现表明，该应用在诊断平台上具有用于产生来自非感染性生物体的替代阳性NAA信号的希望。目前，MTB/RIF测定的校准标准品是在结核分枝杆菌H₃₇Rv的实验室菌株中生产的，其程序冗长，危险且昂贵，因为它需要大量生产活细菌，然后将其杀死以使它们安全处理和运输。修饰的耻垢分枝杆菌有望成为大规模校准标准生产，外部质量评估和一般临床监测的替代品，因为预计这些诊断的全球需求将增加。

目前WHO规定的TB治疗方案包括四种药物：异烟肼(INH)，吡嗪酰胺(PZA)，乙胺丁醇(EMB)和利福平(RIF)。RIF通过结合转录复合物的RNA聚合酶(RNAP)β亚基RpoB而有效杀死结核分枝杆菌，因此抑制RNA的合成从而抑制蛋白质的合成。通过非同义氨基酸取代产生抗性，所述非同义氨基酸取代阻止RIF与RNAP的活性位点结合，同时保留复合物的功能。在RIF存在下，在临床和实验室中，敏感菌株被针对性选择，这导致抗药性突变菌株的生长。虽然RIF抗性突变(RIF^R)在正常生长条件下具有适应性成本，但这些抗性菌株通过其染色体编码适应在所有其他RIF易感(RIF^S)菌株死亡的条件下确保了它们自身的存活。

大多数RIF^R菌株具有限于rpoB基因内的有限序列(即81bp RIF抗性决定区(RRDR))的单核苷酸多态性(SNP)突变。作为一线抗结核药物之一，RIF的功效和低成本对于持续使用抵抗药物敏感的临床菌株至关重要。发病率和死亡率的预防因为治疗感染了对方案中的抗生素无反应的抗性菌株的患者而被不利影响。此外，这些患者促成社区中抗性细菌的传播。为了让临床医生做出明智的决定，涂片镜检不再足够。理想情况下，药敏试验(DST)需要与致病因子结核分枝杆菌的鉴定一起进行。