[发明专利]用于检测博德特氏菌属的方法

权利要求书

1.一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种(Bordetellaspecies)的存在的方法，其包括：

(a)使该生物样品与下列接触：

i.扩增IS481靶核酸的第一引物对，其包括与SEQ ID NO:1或其互补序列至少85-95％相同的核苷酸；

ii.扩增IS1001靶核酸的第二引物对，其包括与SEQ ID NO:2或其互补序列至少85-95％相同的核苷酸；和

iii.扩增hIS1001靶核酸的第三引物对，其包括与SEQ ID NO:3或其互补序列至少85-95％相同的核苷酸；

以在其中发生IS481、IS1001和hIS1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；

(b)使所述反应-样品混合物经受实时PCR条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；

(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的荧光信号；和

(d)通过评估各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在，由此

i.当检测到针对hIS1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(B.holmesii)；

ii.当检测到针对IS1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；和

iii.当检测到针对IS481靶核酸的荧光信号且未检测到针对hIS1001的荧光信号时，在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(B.pertussis)；

其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种；和

其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

2.权利要求1的方法，其中该第一引物对由包含5’CCATAAGCATGCCCGATT 3’(SEQ IDNO:11)的第一正向引物和包含5’CGCTTCAGGCACACAAACT 3’(SEQ ID NO:10)的第一反向引物对组成。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中该第二引物对由包含5’CGGCTCGACGAATTGC 3’(SEQ ID NO:7)的第二正向引物和包含5’AGTTCGTCACGCAGGACAT 3’(SEQ ID NO:8)的第二反向引物组成。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中该第三引物对由包含5’GGCACGGATCGAGGTTTTT 3’(SEQ ID NO:4)的第三正向引物和包含5’TACGGCCGTGAAGTGATAGA 3’(SEQ ID NO:5)的第三反向引物组成。

5.权利要求1-4任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:1的IS481靶核酸的区段的第一核酸探针接触，其中该第一核酸探针是可检测标记的且包含5’TCAATTGCTGGACCATTTCGAGTCGAC 3’(SEQ ID NO:12)。

6.权利要求5的方法，其中该第一核酸探针是用FAM荧光团可检测标记的。

7.权利要求1-6任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:2的IS1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触，其中该第二核酸探针是可检测标记的且包含5’CAACCAGCCGCTGCTGACGGTC 3’(SEQ ID NO:9)。

8.权利要求7的方法，其中该第二核酸探针是用CFR610荧光团可检测标记的。

9.权利要求1-8任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至SEQID NO:3的hIS1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触，其中该第三核酸探针是可检测标记的且包含5’AGTCGCTGGCTACTGCTGCGCA3’(SEQ ID NO:6)。