[发明专利]数字邻近试验

说明书

提供了确定样品中靶标是否存在的方法。还提供了进行本文所述方法的试剂盒。

本申请要求2016年5月25日提交的美国申请62/341,550的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

邻近试验允许对样品中的一种或多种分析物进行灵敏、快速和方便的检测或定量。邻近试验采用一对寡核苷酸标记的抗体来检测特异性靶标。设计寡核苷酸以直接或通过接头杂交，以在2个抗体同时结合靶标时形成新DNA模板。然后使用实时聚合酶链反应(PCR)来检测所得的DNA模板。为了对靶标的量进行定量，使用标准曲线来将Cq值与DNA模板和由此与靶标浓度相关联。

在邻近试验中，背景信号的主要来源是由于不与靶标结合的2个寡核苷酸探针的自发结合。为了最小化背景，在较低的探针浓度下进行邻近试验。因此，生成的DNA模板的最终数量低于靶分子的实际数量。这可能限制试验的灵敏度。

发明内容

本文公开了检测样品中是否存在靶标的方法。

在一个实施方式中，方法包括使样品和与固体支持物连接的第一亲和剂接触，其中所述第一亲和剂特异性结合靶标上的第一表位；洗涤固体支持物；用含有能够特异性结合靶标上的第二表位的第二亲和剂和能够特异性结合靶标上的第三表位的第三亲和剂的溶液孵育固体支持物，其中第二亲和剂附着于第一寡核苷酸并且第三亲和剂附着于第二寡核苷酸，第二寡核苷酸能够在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时与第一寡核苷酸直接或间接相互作用；使第一和第二寡核苷酸通过以下相互作用：(a)与第一和第二寡核苷酸各自的至少一部分互补的第三寡核苷酸的杂交，然后连接第一寡核苷酸与第二寡核苷酸，或(b)第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交；洗涤固体支持物；任选形成DNA模板；释放DNA模板并形成包含DNA模板的溶液；从溶液形成多个分区，其中分区的亚组含有DNA模板；扩增分区的亚组中的DNA模板；并通过检测多个分区中是否存在扩增的DNA模板来检测样品中是否存在靶标。在一些实施方式中，该方法还包括通过确定包含靶标的分区的数量和分区的总数来对靶标进行定量。

在一些实施方式中，第一、第二和第三表位至少部分重叠。在一些实施方式中，第二表位位于第一靶标上并且第三表位位于第二靶标上(例如，具有不同亚基的蛋白质)。在一些实施方式中，靶标(例如，二聚体蛋白质或聚集体形成蛋白质)具有重复的相同表位，使得第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。

在一些实施方式中，多个分区各自是液滴。在一些实施方式中，形成DNA模板的步骤包括延伸第三寡核苷酸的3’末端。在某些实施方式中，形成DNA模板的步骤包括延伸第一寡核苷酸和/或第二寡核苷酸的3’末端。在一些实施方式中，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交包括形成DNA模板步骤。

在一些实施方式中，第二和第三亲和剂的浓度至少等于第一亲和剂的浓度。在某些实施方式中，释放步骤包括通过限制性内切酶切割DNA模板中的位点。在一些实施方式中，释放步骤包括DNA模板的物理、化学或酶促切割。在一些实施方式中，释放步骤包括通过蛋白酶或通过pH的变化来切割亲和剂-寡核苷酸复合物的至少一部分。

在一些实施方式中，扩增步骤包括PCR。在一些实施方式中，靶标是蛋白质或蛋白质聚集体。在某些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自是抗体或抗体片段。在一些实施方式中，固体支持物是颗粒或反应容器的表面。

在一些实施方式中，用于检测样品中靶标是否存在的试剂盒包含与固体支持物连接的第一亲和剂，其中所述第一亲和剂特异性结合靶标上的第一表位；和第二亲和剂，其能够特异性结合靶标上的第二表位；以及第三亲和剂，其能够特异性结合靶标上的第三表位，其中第二亲和剂与第一寡核苷酸偶联并且第三亲和剂与第二寡核苷酸偶联，第二寡核苷酸能够在第一和第二寡核苷酸紧密靠近时直接或间接与第一寡核苷酸相互作用。在一些实施方式中，试剂盒还包含由以下组成的至少一种组分：连接酶，限制性内切酶，DNA聚合酶，dNTP，缓冲剂，PCR主混合物，和用于进行检测样品中靶标的方法的说明书。

附图说明