[发明专利]酶促核酸合成

说明书

本公开提供了用于制备多核苷酸的方法，其中核苷酸的添加可经物理、化学和/或酶促控制。该方法包括将选定的核苷酸、阳离子、易错或非模板依赖性DNA聚合酶于反应位点组合，所述反应位点包含与其连接并且具有3'末端核苷酸的起始物序列，其中反应试剂可经调节并且处于允许一个或多个选定的核苷酸共价添加至3'末端核酸的情况，从而使得选定的核苷酸成为3'末端核苷酸，并且重复添加步骤直到多核苷酸形成。

相关申请数据

本申请要求于2016年4月4日提交的美国临时申请号62/317,919号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明是基于国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供的5R01MH103910和1R01MH103910-01政府资助。政府对本发明享有某些权利。

技术领域

本发明一般涉及使用酶促合成制备寡核苷酸和多核苷酸的方法。

背景技术

DNA被认为是一种非常理想的数字信息存储介质。DNA这类用途的障碍是当前合成方案的高成本以及低效率和速度。在现有技术中，使用亚磷酰胺前体在有机溶剂中合成DNA。这些化学合成方法导致大约1％的错误，并且每个添加步骤花费大约10分钟。此外，在该合成过程中使用的试剂是昂贵的。一些相同试剂也会破坏DNA，这个问题将合成长于约200个碱基的DNA链的可能性排除，进一步妨碍了该化学过程的效率。尽管进行了多次努力，但是之前并未描述使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)合成定制核酸序列的可行方法。TdT目前用于间歇反应，用于向核酸序列的3'末端添加可变长度的单个核苷酸或不受控制的核苷酸混合物序列。控制TdT纳入核苷酸数量和性质以生成用户所定义核酸序列的方法是一个尚未解决的重大挑战。因此，仍然存在开发比现有化学寡核苷酸合成方法更快且更便宜的酶促寡核苷酸合成方法的需求。

发明内容

本公开解决了该需求，并且基于使用非模板依赖性DNA聚合酶合成所需序列的核酸方法的发现。根据本公开的方法将核酸聚合物依次暴露于将聚合物延伸所需长度的核苷酸聚合单元(NPU)。本公开所提供的是，各NPU包括末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)以及一种类型的核苷酸底物(如A、C、G和T/U)。核苷酸底物为核苷酸三磷酸的形式，其对于本发明所考虑的聚合目的为活性形式。本公开提供了新型物理、化学和酶促方法以控制NPU延伸并且将它们限制于数个核苷酸。这些新型方法克服了在通用实验室条件下所遇到的问题，其中NPU将不确定地且不受控地延伸核酸聚合物。这些新型方法提供了DNA聚合物顺序暴露于含有不同核苷酸的NPU并获得所需序列的核酸聚合物，从而为将数字信息酶促编码成DNA提供了基础。这些新型方法提供了对核苷酸数量和性质改善的控制，非模板依赖性DNA聚合物(如TdT)纳入核酸聚合物并使用户定义的核酸序列合成能够用于生物应用。

根据本公开与从头合成核酸最相关的酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，其是延伸单链寡核苷酸的一种独特DNA聚合酶。关键地，TdT为非模板依赖性，一种基于提供的核苷酸的可及性使碱基纳入生长的核酸链的性质。该性质使TdT成为一种有吸引力的DNA聚合酶，用于重头DNA合成。

本公开提供的是，在理想情况下，有希望将通过TdT的添加数量限制为1。这样的DNA不仅适用于数字信息存储，也可以用于生物/遗传应用。本公开还提供了，对于将信息储存到DNA中，将添加限制为1并不是必需的。一种示例性的合适编码策略可以用于数字存储目的，其并不将各碱基作为信息的单元，而是将一个或多个相同的碱基的各延伸(即同聚物)作为信息的单元。例如，如果A或T的每个延伸代表0，那么C或G的每个延伸代表1，那么序列“AAATTAACCCCGGACTTAAGGGCC”将等于“ATACGACTAGC”，并且代表“00011010011”。