[发明专利]全转录组扩增的方法

权利要求书

1.一种从一个或多个细胞扩增RNA的方法，其包括以下步骤：

将来自所述一个或多个细胞的RNA暴露于第一多种引物和至少一种逆转录酶以产生反应混合物；

使所述反应混合物经受允许所述引物与RNA退火和第一链cDNA合成以产生延伸的DNA链的条件；

消化未退火的引物；

使所述反应混合物中的酶失活；

消化所述反应混合物中的RNA；

对所述延长的DNA链的3'末端进行加尾；

在合适的条件下使用第二多种引物和至少一种DNA聚合酶产生第二链cDNA合成，以产生双链全扩增子，其中所述第一多种引物、第二多种引物或两者中的引物包含下式：

XnYmZp，

其中n大于2且X富含40％-60％的G或富含40％-60％的C，其中Y为任何核苷酸且m为5-8个核苷酸，并且，其中当X富含G时，Z为T或G，或者当X富含C时，Z为C，其中p为2-20个核苷酸。

2.权利要求1的方法，其中m为5个核苷酸。

3.权利要求1或2的方法，其中p为3个核苷酸。

4.权利要求1或2的方法，其中p为20个核苷酸。

5.权利要求1或2的方法，其中n为20-40个核苷酸。

6.权利要求5的方法，其中n为25-35个核苷酸。

7.权利要求5的方法，其中n为24-28个核苷酸。

8.权利要求1或2的方法，其中所述第一链cDNA合成使用逆转录酶Superscript II、Superscript III或Superscript IV。

9.权利要求1或2的方法，其中所述第一多种引物与所述RNA的退火和/或所述第二多种引物与所述DNA的退火在0-10℃的范围内进行。

10.权利要求1或2的方法，其中第一链cDNA合成至少在30-55℃进行。

11.权利要求1或2的方法，其中用具有3'至5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶和/或外切核酸酶中的至少一种消化所述未退火的引物。

12.权利要求11的方法，其中所述具有3'至5'外切核酸酶活性的DNA聚合酶和/或核酸外切酶是T4 DNA聚合酶和/或外切核酸酶I中的至少一种。

13.权利要求1或2的方法，其中消化所述引物在60℃-65℃的范围内的温度进行。

14.权利要求1或2的方法，其中使所述酶失活在72-95℃的范围内的温度进行。

15.权利要求1或2的方法，其中消化所述RNA用至少一种核糖核酸酶进行。

16.权利要求15的方法，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H和/或RNA酶If中的至少一种。

17.权利要求1或2的方法，其中消化所述RNA在30-50℃的范围内的温度进行。

18.权利要求1或2的方法，其中对所述延伸的DNA链的3'末端加尾使用至少一种末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行。

19.权利要求18的方法，其中所述末端脱氧核糖核苷酸转移酶是TdT末端转移酶。

20.权利要求1或2的方法，其中对所述延伸的DNA链的3'末端的加尾使用脱氧胞苷三磷酸或脱氧鸟苷三磷酸进行。