[发明专利]通过测序进行的神经元投射的多重分析

说明书

本发明提供了包含多个标记的神经元的组合物，每个标记的神经元是由编码独特条形码核酸的表达构建体标记的。

本申请要求于2016年4月8日提交的第62/320,386号美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

在整个申请中，引用了各种出版物，包括在括号中引用的那些。对括号中引用的出版物的完整引用在紧接在权利要求之前的说明书末尾列出。所有引用的出版物的公开内容通过引用整体并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。

本发明是在政府支持下在美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号NS073129、DA036913和CA045508下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

已经在小鼠大脑中系统地定位出了区域到区域的连接，但是仅使用了整体标记(bulk labeling)技术，该技术掩盖了由混合的异源群体引起的单个神经元投射的多样性。本文描述了一种新方法，其中将随机核苷酸序列(“条形码”)引入神经元中以将投射定位(projection-mapping)转换成利用高通量测序(HTS)技术的形式。在基于测序的投射多重分析(MAPseq)中，通过RNA条形码的病毒表达标记单个神经元轴突投射，从而获得用于确定一大群单个神经元的投射靶标的有效且大规模的平行方法。将MAPseq应用于蓝斑(LC)并且证明了大多数单个LC神经元具有偏爱的皮层靶标。通过将传统上被视为显微镜学难题的神经解剖学重建为测序难题，MAPseq利用HTS的发展来允许对脑回路的高通量询问。

发明内容

神经元通过远程轴突投射将信息传递到远处的大脑区域。在一些情况下，功能上不同的神经元群体在小区域内混合。例如，下丘脑核附近介导包括食欲、攻击性和性吸引力在内的基本欲望(Kennedy et al.,2014；Sternson,2013)，并且来自这些核的神经元投射到不同的靶标。在视觉皮层区域V1中，对视觉刺激的响应与神经元所投射到的高级视觉区域的特性相匹配(Glickfeld et al.,2013；Movshon and Newsome,1996)。诸如此类的发现表明，单个神经元传输的信息可以根据其靶标进行调整。然而，目前还没有用于确定单个神经元的不同投射模式的高通量方法。

目前，在定位远程连接的解剖学方法中，通量和分辨率之间存在着显著的折衷关系。在传统的脑成像(brain mapping)研究中，荧光或酶标记用于通过光学显微镜使细胞体和远端投射可视化。使用整体标记技术实现最大通量，该技术对神经元群体的总体结构进行采样(Oh et al.,2014)。这样的方法很快速，并且已经进行了几次大规模的努力来系统地绘制介观连接性(Oh et al.,2014；Zingg et al.,2014)。然而，这种整体方法掩盖了由异源神经元群体引起的单个神经元投射的多样性。例如，考虑到投射到三个下游区域的单个源区域(图1a)。该投射模式意味着该源区域中的神经元可以向三个下游区域发送信息。然而，相同的整体投射模式可以以多种方式出现：一对一体系，其中每个神经元仅靶向一个下游区域(左)；一对多体系，其中每个神经元靶向每一个下游区域(中间)；或者更复杂的体系(右)。尽管可以通过利用被工程化以在遗传限定的神经元亚群中表达标记物(例如重组酶)的转基因动物来改进整体标记方法(Tasic et al.,2016)，但是这些策略预先假定标记物靶向多个功能类别的神经元。

区分图1a中所示的体系需要单神经元分辨率。目前实现单神经元分辨率的方法需要单独标记每个大脑的一个或最多几个细胞(Economo et al.,2016)，这是一种劳动密集型方法，以低通量为代价提供高分辨率。虽然可以通过用不同颜色的荧光团标记单个神经元来多重复用单神经元追踪(Ghosh et al.,2011；Livet et al.,2007)，但实际上多重复用化的程度受到颜色数量的限制-通过显微镜法可以解析最多5-10种颜色。