[发明专利]表征和成像微观物体的方法

说明书

一种微观物体表征系统(1)，包括计算机系统(2、2a、2b)、具有连接到该计算机系统的计算单元(5)的显微镜(4)，以及可在计算机系统中执行的物体表征程序(17)，物体表征程序(17)被配置为接收折射率数据，该折射率数据表示至少所述微观物体的折射率(RI)的测得的值或与折射率相关的值的空间分布。物体表征程序可操作，以执行对所述折射率数据应用多个变换的算法。变换生成用于表征微观物体的特征的两个或更多个参数的分布。计算机系统还包括反馈接口，该反馈接口被配置为经由诸如互联网之类的全局通信网络连接到网络计算系统中的一个或多个数据服务器，并且被配置为从数据服务器接收反馈数据以供物体表征程序处理，以校准、精炼或增强所述特征的表征。

技术领域

本发明涉及一种用于表征和成像微观物体，特别是生物标本的方法和系统。特别地，本发明可以用于细胞生物学领域及其基于非侵入性光学成像技术的定量。

背景技术

能够直接与生物标本(诸如活细胞标本)相互作用在医学、药学、化妆品、基础研究和教育领域开辟了广泛的新应用。自从细胞于17世纪被发现以来，工程师们一直在努力提高成像系统的光学分辨率。但是，由于细胞的透明性质，难以在不损坏细胞的情况下对活细胞进行成像。

对增加分辨率的限制通过两个光散射体可以被识别为分开的最小距离表现出来。直到最近，提高分辨率的努力主要涉及由非相干照明仪器获得的基于强度的图像场。与非相干技术相反，相位和其它电磁场特性强烈影响利用相干光技术可实现的分辨率。与基于强度的成像系统相比，一种这样的技术，全息显微镜，具有较差的横向分辨率。

不过，非相干照明和相干层压系统共享图像形成理论的许多基本方面。基于在远场中传播的光的微观物体的高分辨率成像由于其与有限能量相关联的有限光谱而满足分辨率限制。这些频谱限制既适用于时间也适用于空间域。带宽限制自然地在空间频率域(SFD)中引入带止(bandstop)或带阻滤波器。因此，空间频率域的占用限于光学系统带宽的有限区域[Goodman，1968]。进一步的限制是由于仪器的考虑，特别是波场的有效光谱进一步受到收集散射物体波的仪器的配置的限制。光进入锥体内的显微镜物镜(MO)，该锥体截取显微镜物镜的瞳孔。在数学上，角度光谱受到显微镜物镜的数值孔径(NA)的限制。光谱表现出乘以称为相干传递函数(CTF)的复函数，它是复值振幅点扩散函数(APSF)的傅立叶变换。APSF的平方是强度点扩散函数(IPSF)或更常见地是点扩散函数(PSF)。PSF通常被认为是对强度图像进行限定。相干传递函数的自相关是点扩散函数的傅立叶变换，并且通常称为光学传递函数(OTF)。它通常被认为是光学仪器的带宽以及因此分辨率的描述符。

在通过空间带宽传送信息方面对成像的理解指示克服其限制的方法，特别是通过去卷积。去卷积方法可以通过去模糊、增强光学切片能力或提高分辨率来改善一般图像质量。这种益处使得去卷积成为生物应用的常见后处理方法，诸如荧光显微图像的去卷积。已经开发了许多用于非相干成像的标准去卷积技术。

基于全息断层摄影术[Cotte等人，Nature Photonics 7(2013)113-17，US 8,937,722，EP2998776]，生物样本的三维(3D)折射率(RI)分布可以在没有标记物且不损坏标本的情况下实现。通过全息和旋转扫描的组合，系统检测光在其传播通过细胞时的变化。这种光路形成Mach-Zehnder干涉仪设置(set-up)的一个臂，另一个臂是参考路径。样本束可以以非常陡的角度通过旋转照射臂照射样本。全息图由数码相机记录，该数码相机将通过样本的光束与参考光束组合。然后将样本光束旋转一个小角度并重复该过程，每个光束位置记录一个全息图。使用上面提到的显微镜，与大多数光学显微镜一样，通过全息断层摄影术测得的参数既不是外源分子的吸收也不是荧光强度。相反，样本的物理折射率是以三维(3D)分布获得的，其分辨率优于显微镜物镜给出的衍射限制。输出是生物标本(例如细胞)内的折射率分布。结果是体外定量细胞断层摄影术，没有任何侵入性样本制备，特别是不使用荧光标记物。通过采用合成孔径和多视点全息方法来实现改善的图像分辨率。在捕获全息图之后，可以通过计算机处理生成样本中每个平面的高分辨率图像。

发明内容