[发明专利]核酸扩增过程中的改进或与核酸扩增过程相关的改进

权利要求书

1.一种进行非等温核酸扩增反应的方法，该方法包括以下步骤：

(a)在允许杂交事件的条件下将靶标序列与一种或多种互补单链引物混合，其中所述引物与该靶标杂交，该杂交事件直接或间接导致形成包含两个切口位点的双链体结构，这两个切口位点位于该双链体的相反两端处或附近；并通过以下步骤执行扩增过程；

(b)在该双链体的链中的每个所述切口位点处产生切口；

(c)使用聚合酶延伸带切口的链以便形成新合成的核酸，该用聚合酶进行的延伸重新产生切口位点；

(d)根据需要重复步骤(b)和(c)，以便导致产生该新合成的核酸的多个拷贝；

其特征在于，执行该方法的温度是非等温的，并且在步骤(b)-(d)的该扩增过程中经历至少2℃的降低。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，该靶标包含两条互补的核酸链，并且所述引物是正向引物和反向引物，这些正向引物和反向引物各自与该靶标的相应链互补，使得这些正向引物和反向引物的3'末端朝向彼此取向。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在该扩增反应期间，该温度经历至少5℃的受控降低。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中该扩增反应期间的平均温度降低速率在-0.10℃ min^-1至-6.0℃ min^-1的范围内。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)-(d)基本上在步骤(a)之后立即执行。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)在55℃至62℃范围内的温度下执行。

7.根据权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括直接或间接检测该新合成的核酸的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测步骤包括使用分子信标或荧光染料、横向流标记的探针或催化电化学反应的酶。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)包括使用切口酶。

10.根据权利要求1或2所述的方法，该方法包括使用具有最佳温度的第一聚合酶和/或第一切口酶，和具有最佳温度的第二聚合酶和/或第二切口酶，其中该第二聚合酶和/或第二切口酶的该最佳温度低于相应的第一聚合酶和/或第一切口酶的该最佳温度。

11.根据权利要求10所述的方法，其中该第二聚合酶是Bsu聚合酶、或是DNA聚合酶的克列诺片段。

12.根据权利要求10所述的方法，其中该扩增反应的初始温度等于或高于该第一切口酶的最佳温度，并且在该扩增反应过程中该温度降低至低于该第一切口酶的最佳温度的温度。

13.根据权利要求10所述的方法，其中该扩增反应的温度降低至或低于该第二聚合酶和/或第二切口酶的最佳温度。

14.根据权利要求1或2所述的方法，该方法进一步包括使通过执行该方法而获得的混合物与降解核酸的不耐热的酶接触的步骤，该混合物在该不耐热的酶具有实质性活性的温度下与该不耐热的酶接触。

15.根据权利要求14所述的方法，其中该酶是鳕鱼尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)或南极不耐热UDG。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)之前执行逆转录步骤，包括使所关注的RNA分析物与逆转录酶接触，以便形成该所关注的RNA分析物的DNA转录物。

17.根据权利要求16所述的方法，该方法进一步包括从该DNA转录物制备双链DNA的步骤。