[发明专利]酶促核酸合成

说明书

本公开提供了使用电将反应区和反应位点的pH从失活pH(该pH下酶无活性)改变至活化pH(在该pH下酶具有活性)来活化酶(如易错或非模板依赖性聚合酶)以将核苷酸添加至起始物或生长的聚合物链的方法。然后可以将活化pH变回失活pH，并且可以如所需重复多次该过程以产生靶核酸序列。

相关申请数据

本申请要求于2017年5月9日提交的美国临时申请号62/333,501号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明是在政府支持下由国家卫生研究院授予的基金号1R01MH103910-01资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。

技术领域

本发明一般涉及使用酶促合成制备寡核苷酸和多核苷酸的方法。

背景

DNA被认为是一种非常理想的数字信息存储介质。DNA这类用途的障碍是当前合成方案的高成本以及低效率和速度。在现有技术中，使用亚磷酰胺前体在有机溶剂中合成DNA。这些化学合成方法导致大约1％的错误，并且每个添加步骤花费大约10分钟。此外，在该合成过程中使用的试剂是昂贵的。一些相同试剂也会破坏DNA，这个问题将合成长于约200个碱基的DNA链的可能性排除，进一步妨碍了该化学过程的效率。TdT目前用于间歇反应，用于向核酸序列的3'末端添加可变长度的单个核苷酸或不受控制的核苷酸混合物序列。仍然存在开发比现有化学寡核苷酸合成方法更快且更便宜的酶促寡核苷酸合成方法的需求。

发明内容

本公开涉及使用电流在反应区内产生活化酶(如易错或非模板依赖性聚合酶)的pH以添加核苷酸如三磷酸核苷酸至起始物。该方法能够使用酶促聚合物合成产生一个或多个多核苷酸。例如，酶如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)(其在不使用模板的情况下用三磷酸核苷酸延伸单链核酸模板)与一个或多个三磷酸核苷酸如A、C、G或T/U(dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP)或非天然产生或合成的三磷酸核苷酸和其他试剂在酶为失活的pH条件下组合。电流用于在反应区内反应位点改变pH以活化酶，从而将一个或多个三磷酸核苷酸添加于起始物序列或生长的核酸序列。使用施加于不同反应位点的不同电压，可以平行地进行数个反应以产生数个核酸。本公开提供了将核酸顺序暴露至不同核苷酸以获得所需序列的核酸聚合物。

根据本公开的方法可以用于合成更便宜、更准确且更长的定制DNA序列，用于生物化学、生物医疗或生物合成应用。此外，考虑到高速DNA合成的潜能，根据本公开的方法可以促进DNA作为信息存储介质的用途。在该情况中，固相合成装置可以用于记录DNA分子中的数字信息。

本发明的某些实施方式的其他特征和优势将在权利要求中以及以下附图和实施方式的说明下更为显而易见。

附图说明

结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1描绘了根据本公开方法的实施方式筛选的TdT核苷酸类似物底物，以选择对延伸效率、速率和延伸长度分布更好性能。

图2描述了TBE-尿素凝胶上TdT酶活性的pH调节的结果。

图3描述了TBE-尿素凝胶上TdT酶活性的可逆pH调节的结果。各泳道顶端值表示在开始聚合反应之前孵育TdT的pH。各泳道底部值表示聚合反应期间调节的pH。

图4是用于制造用于本文所述方法的电化学电池的聚乙烯膜上铟锡氧化物涂层中蚀刻的图案的示意图。

图5是用于制造用于本文所述方法的电化学电池的双面粘合剂框的示意图。

图6是用于制造用于本文所述方法的电化学电池的组件的示意图。