[发明专利]用于检测核酸突变的组合物和方法

权利要求书

1.一种用于在来自哺乳动物的样品或其部分中检测靶基因中的突变的方法，所述方法包含：

a）通过将聚合酶、脱氧核苷三磷酸、来自由所述样品产生的核酸文库的核酸片段、一系列正链正向靶特异性引物和正链反向通用引物进行组合，从而形成初始反应混合物，其中所述核酸片段包含反向通用引物结合位点，其中一系列正向靶特异性引物包含结合至一系列覆瓦式靶特异性引物结合位点的5至250个引物，所述靶特异性引物结合位点在所述靶基因上以10至100个核苷酸间隔开；

b）使所述初始反应混合物经历初始扩增条件，以产生使用引物对产生的靶扩增子，所述引物对包含所述一系列正向靶特异性引物中的引物中的一个和所述反向通用引物；以及

c）分析所述靶扩增子中的至少一部分的核酸序列，从而检测所述靶基因中的突变。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析包含：使用大规模平行测序来确定所述靶扩增子中的至少一部分的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述正链正向靶特异性引物是正链正向靶特异性外部引物，并且所述正链反向通用引物是正链反向通用外部引物，并且其中所述方法在所述分析之前还包括：

a）通过将外部引物靶扩增子、聚合酶、脱氧核苷三磷酸、反向内部通用引物和一系列正向靶特异性内部引物进行组合，从而形成内部引物反应混合物，所述靶特异性内部引物包含结合至一系列覆瓦式靶特异性内部引物结合位点的5至250个引物，所述靶特异性内部引物结合位点在靶基因上以10至100个核苷酸间隔开并且每个都在至少一个外部引物靶扩增子上被发现，所述一系列正向靶特异性内部引物被配置成在与一系列靶特异性外部引物相同的方向上引发延伸反应；以及

b）使所述内部引物反应混合物经历内部引物扩增条件，以产生使用引物对产生的内部引物靶扩增子，所述引物对包含所述正向靶特异性内部引物中的一个和所述反向内部通用引物，其中其核酸序列被分析的扩增子包含所述内部引物靶扩增子，其中被分析的核酸序列是所述外部引物靶扩增子的一部分。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶特异性内部引物结合位点与靶特异性外部引物结合位点重叠0至25个核苷酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述反向内部通用引物包含与反向外部通用引物相同的核苷酸序列。

6.根据权利要求3所述的方法，其中一系列覆瓦式靶特异性外部引物结合位点和所述靶特异性内部引物结合位点在1至100个靶基因中的每一个的靶区域上被发现。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在1至100个靶基因中的每一个上，所述外部引物靶扩增子中的至少50％或至少75％与所述外部引物靶扩增子中的至少另外一个具有重叠序列，其中每个靶区域包含500至10,000个核苷酸并且其中所述靶区域包含与疾病相关的已知突变。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述外部引物靶扩增子中的至少50％和所述内部引物靶扩增子中的至少一个具有重叠序列。

9.根据权利要求7所述的方法，进一步包含：

a）通过将聚合酶、脱氧核苷三磷酸、来自由所述样品产生的核酸文库的核酸片段、一系列负链正向靶特异性外部引物和负链反向外部通用引物进行组合，从而形成负链外部引物反应混合物，其中所述核酸片段包含负链反向外部通用引物结合位点，其中所述一系列负链正向靶特异性外部引物包含结合至一系列覆瓦式负链正向靶特异性外部引物结合位点的5至250个引物，所述负链正向靶特异性外部引物结合位点在靶基因上以10至100个核苷酸间隔开，其中所述负链正向靶特异性外部引物结合位点位于被所述靶特异性外部引物靶定的链的负链上；

b）使所述负链外部引物反应混合物经历扩增条件，以产生使用引物对产生的负链外部引物靶扩增子，所述引物对包含所述一系列负链正向靶特异性外部引物中的引物中的一个和所述负链反向外部通用引物；以及

c）分析所述负链外部引物靶扩增子中的至少一部分的核酸序列，从而检测所述靶基因中的突变。