[发明专利]α-突触核蛋白检测测定法和用于诊断α-突触核蛋白病的方法

说明书

提供了检测生物样品中α‑突触核蛋白聚集体存在的方法，其中将生物样品与反应样品混合以形成反应混合物，所述反应样品包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α‑突触核蛋白或其片段或变体，对反应混合物进行照射并同时以间歇式搅拌循环进行孵育，其中孵育期间反应混合物的荧光显著增加表明生物样品中存在α‑突触核蛋白聚集体。诊断α‑突触核蛋白病如帕金森病或路易体痴呆的方法。

技术领域

本发明涉及用于检测生物样品中的聚集蛋白质的测定法，更具体地涉及用于检测生物样品中的聚集α-突触核蛋白的测定法。

背景技术

α-突触核蛋白(a-syn)是一种140个氨基酸的非常保守的酸性小蛋白质，分子量为19kDa，其由位于4号染色体上的SNCA基因编码¹。它以高浓度位于中枢神经系统的突触前神经末梢，在此其对突触小泡生物学发挥作用²。突触核蛋白病是一组与神经元和神经胶质的选择性群体中a-syn的纤维性聚集体的沉积有关的神经退行性病症。这些沉积物可见于神经胞体(如路易体(LB))中或如帕金森病(PD)或路易体痴呆(DLB)的疾病的营养不良神经突起中；或多系统萎缩症(MSA)的神经胶质细胞质包涵体中³。

已经在如脑脊液(CSF)⁴和血清⁵的生物流体中检测到存在a-syn。已经提议将由ELISA测量CSF中的a-syn浓度作为用于与a-syn相关病症的生物标志物。然而，尽管许多研究表明在PD和DLB中CSF a-syn水平降低^4,6，但是总体结果并不一致⁷。即使在已经证实CSFa-syn降低的那些研究中，差异虽很小⁸，但是在患者组内以及在患者组和对照组之间存在相当大的重叠。此外，已证明将实验室之间CSF a-syn测量标准化是困难的⁹。

最近已经将a-syn的聚集特性与朊蛋白进行了比较，该朊蛋白的聚集会导致传染性海绵状脑病(TSE)¹⁰。实际上，目前文献有很多关于α-突触核蛋白病是否实际上是朊病毒样疾病的讨论¹¹。已经将最近所描述的一种被称为实时震动诱导转换(RT-QuIC)的技术(该技术利用朊病毒蛋白诱导自聚集的能力)开发用于散发性克雅二氏症(sCJD)的诊断性CSF测试，该散发性克雅二氏症是最常见人类形式的TSE¹²。

然而，鉴于朊病毒蛋白和a-syn之间的显著差异，这些技术未能以任何可靠的方式检测到生物样品中a-syn或a-syn聚集体的存在。因此，对于检测生物样品中a-syn和a-syn聚集体存在的可靠测定法仍然存在需求。

本发明的至少一个目的是提供用于检测生物样品中a-syn和/或a-syn聚集体存在的改进的测定法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了检测生物样品中α-突触核蛋白聚集体存在的方法，该方法包括以下步骤：

(i)提供生物样品；

(ii)提供反应样品，其包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α-突触核蛋白或其片段或变体；

(iii)将生物样品和反应样品混合以形成反应混合物；

(iv)以间歇式搅拌循环孵育反应混合物；

(v)用激发反应样品荧光团的波长的光照射样品；和

(vi)确定在孵育期间反应混合物的荧光水平，

其中步骤(iv)至(vi)同时进行，并且在步骤(iv)至(vi)期间反应混合物的荧光显著增加表明在反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体，并且其中在反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体表明在生物样品中存在α-突触核蛋白聚集体。