[发明专利]高度糖基化CEA特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用

说明书

本发明提供了一种糖基化CEA特异性单链抗体，以及一种靶向糖基化CEA的嵌合抗原受体(CAR)，可用于制备诊断或治疗过表达糖基化CEA的肿瘤的试剂或药物。

技术领域

本发明涉及到肿瘤免疫治疗领域，更具体的，本发明涉及糖基化CEA特异性单链抗体，以及对过表达糖基化CEA的肿瘤的转基因修饰的过继T淋巴细胞治疗领域。

背景技术

胃癌的发病率在我国居消化道恶性肿瘤之首，在世界上居第二位，年死亡数约占恶性肿瘤死亡人数的24％，五年生存率仅约为27％。胃癌患者的诊断发现往往已到晚期，因此预后极差。针对胃癌并无有效的靶向治疗药物。CEA(carcinoembryonic antigen)癌胚抗原，是一种膜结合蛋白，一般在胎儿肝肠胰等组织表达。正常分泌入肠道，血清中含量很少。细胞癌变时，血清中水平升高，对胰腺癌、结肠癌早期诊断有辅助意义，对肿瘤的扩散、疗效、复发和预后有一定的参考价值。第四军医大学樊代明教授发现糖基化的CEA对多种消化道癌的敏感性特异性都很高。临床研究表明，糖基化CEA在胃癌组织中的阳性率在80％以上，在结肠癌组织中阳性率在40％以上，在胃癌前病变阳性率在30％以上，在食道癌组织中阳性率在18％以上。同时临床实验结果显示，28例胃癌患者术后血清中糖基化CEA的阳性率比术前明显下，提示糖基化CEA与胃癌发病存在着密切关系(Gadler et al.,Int J Cancer25(1):91-4，1980)。

目前，新兴的具有靶向性过继细胞治疗技术嵌合抗原受体T淋巴细胞(Chimericantigen receptor T cell，CAR-T)在多种恶性肿瘤治疗中均发挥着重要作用，CAR-T是将如单链抗体、特异性受体等针对肿瘤相关抗原(TAA)特异性识别肽段与T细胞激活信号如CD3zeta融合偶联，并通过如慢病毒等方式将该融合蛋白特异性表达于T细胞表面，使修饰过的T细胞可以对肿瘤细胞进行特异性识别并杀伤，且不依赖于主要组织相容性抗原(MHC)，避免了由于MHC缺失导致的肿瘤免疫逃逸。

嵌合抗原受体包括胞外靶向识别抗原区、铰链区、跨膜区及胞内共刺激信号区。抗原识别区多为单链抗体或者特异性受体，保证修饰的T细胞可以特异性的识别靶细胞，并被激活，对靶细胞产生特异性杀伤作用；铰链区一般采用如CD8α、CD28ECD、IgG Fc片段等，保证T细胞与靶细胞接触距离，影响到T细胞作用；胞内信号区域采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，如CD3zeta及共刺激信号如CD28、CD137、CD27、ICOS、OX40、DAP10等(Sadelain etal.,Cancer Discov3(4):388-98，2013)。

尽管在恶性血液病的治疗中，CAR-T展现出了良好的应用价值，但在实体瘤治疗中，CAR-T往往并不能达到预期效果，甚至在临床研究中，CAR-T可能会存在由于脱靶效应而产生的毒性。其重要原因为，在实体瘤中往往没有一个有效的、特异性强的靶点。对于众多肿瘤相关抗原中，往往在正常组织也有一定程度的表达，如HER2为恶性胶质瘤、乳腺癌等恶性肿瘤的重要靶点，在针对HER2靶点的CAR-T临床实验中，患者在回输CAR-T后出现肺部衰竭，并引发“细胞因子风暴”导致患者在短时间内死亡。因此在实体瘤中找到一个高特异性和高灵敏度的靶点是CAR-T治疗方法在实体瘤中应用的关键点(Morgan et al.,Mol Ther18(4):843-51，2010)。