[发明专利]RNA检测试剂盒和方法

说明书

本发明涉及用于检测RNA分子，特别是小尺寸RNA分子如miRNA的试剂盒和方法。本发明提供了RNA检测试剂盒和方法，其中将用于逆转录的短引物用于逆转录过程，目的是使引物在逆转录反应溶液中迅速扩散并因此减少逆转录反应时间，使得能够提高整体PCR反应速率并且稳定和迅速地检测RNA。此外，本发明提供了RNA检测试剂盒和方法，其中在逆转录过程之后，通过使用远长于用于逆转录的引物之用于延伸的引物对单链cDNA进行延伸，因此可以获得足够长的模板以进行PCR扩增。

技术领域

本发明涉及用于检测核酸的试剂盒和方法，更具体地涉及用于检测RNA的试剂盒和方法。

背景技术

微RNA(MicroRNA)(下文中缩写为“miRNA”)是由约22个核糖核苷酸组成的非编码RNA。已知miRNA调节转录阶段的RNA沉默和转录后阶段的基因表达。miRNA的这种功能通过与其靶mRNA中的互补序列碱基配对来进行。自从首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现miRNA以来，已经一种接一种地报道了多种miRNA，同时已知其可以在动物、植物和病毒中调节基因表达。此外，已知由miRNA基因的突变引起的功能障碍可能造成某些疾病，例如癌症。因此，已经越来越认识到miRNA的重要性。

由于已知miRNA的长度非常短(约22nt)并且比mRNA更容易降解，因此分离或检测miRNA存在很大困难。用于检测miRNA的常规方法包括Northern印迹分析；使用微阵列的基于杂交的检测；通过包括RT-PCR的两步法来检测和定量某miRNA的方法，其使用与miRNA互补结合的茎-环引物，并且随后进行定量PCR；以及包括以下步骤的方法：使用poly(A)聚合酶在miRNA的3’末端进行poly(A)加尾，使用poly(T)衔接子作为引物合成cDNA，然后使用miRNA特异性正向引物和基于poly(T)衔接子的反向引物对miRNA进行扩增。

然而，上述检测方法的缺点在于，由于互补序列不够长，所以可能发生非特异性扩增，并且由于这些方法通常基于实时PCR，所以需要昂贵的实时PCR系统，并且由于PCR产物具有相似的大小，所以同时检测多种miRNA的多重分析受限。

另外，在用于miRNA检测的常规方法中，由于miRNA的长度短，所以使用具有约70至80聚体的长长度的逆转录引物以确保用于PCR扩增的模板的长度。然而，在这种常规检测方法的情况下，由于其长的长度，逆转录引物在反应溶液中的扩散缓慢，因此逆转录反应时间增加，从而导致总反应时间增加。因此，常规检测方法存在的问题是实时PCR中的C_t值变大并且反应性降低。

发明内容

本发明是为了解决包括上述问题在内的多种问题而完成的，本发明的一个目的是提供用于检测小RNA分子(包括miRNA)的更有效和经济的试剂盒和方法。然而，应该理解，该目的仅是说明性的，并且本发明的范围不受上述目的的限制。

根据本发明的一个方面，提供了用于检测RNA分子的试剂盒，其包含：

短逆转录引物，其由第一杂交寡核苷酸和第一衔接子寡核苷酸构成，所述第一杂交寡核苷酸由与所述RNA分子的poly(A)尾杂交的寡(dT)构成，并且所述第一衔接子寡核苷酸连接至所述第一杂交寡核苷酸的5’末端并且为不与所述RNA分子杂交的任何核酸序列；

延伸引物，其比所述逆转录引物更长并且由第二杂交寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸构成，所述第二杂交寡核苷酸能够与从所述RNA分子逆转录的单链cDNA的3’末端部分特异性杂交，该3’末端部分为所述单链cDNA的除寡(dT)以外的部分，并且所述第二衔接子寡核苷酸连接至所述第二杂交寡核苷酸的5’末端并且具有不与所述单链cDNA杂交的任何核酸序列；以及

正向引物，其具有在所述第二衔接子寡核苷酸序列内的序列。

根据本发明的另一个方面，提供了用于检测RNA分子的试剂盒，其包含：