[发明专利]热稳定聚合酶抑制剂组合物和方法

说明书

本公开内容涉及用于温度依赖性可逆抑制热稳定聚合酶活性的适体，以改进涉及热启动多核苷酸合成的各种反应和测定的灵敏度和特异性。还提供了适体的使用方法和相关的组合物和试剂盒。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月7日提交的USSN 62/347,004的权益和优先权，其全部内容通过引用并入本文，用于所有目的。

序列表的交叉引用

本申请包括序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年6月6日创建的此ASCII副本名为CPHDP012WO_2017-06-06_SeqList.txt，大小为20795字节。

技术领域

本公开内容通常涉及热稳定聚合酶活性的核酸抑制剂、包含所述抑制剂的组合物及其使用方法。所述核酸抑制剂可以适应二级结构以可逆地抑制热稳定聚合酶，其中抑制活性是温度依赖性的。所述抑制剂可用于包括通过热稳定聚合酶的核酸合成的方法和测定，其中方法和测定受益于利用热启动方法。

背景技术

核酸靶序列的体外合成(许多研究测定和诊断产物的基础)通常部分依赖于使用热稳定DNA聚合酶和至少一种寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物被设计来特异性结合在怀疑含有靶标的样品中的靶核酸底物。虽然设计使用聚合酶和引物的测定以产生特定序列，但众所周知，如果测定需要在较低或环境温度下的一段时间，则靶特异性引物可与非靶序列杂交或可形成引物二聚体，导致错误启动(mispriming)并随后产生非特异性产物。这些产品是不希望的，因为它们可以掩盖目的产物以及过早耗尽必要试剂的反应混合物。

用于减少错误启动影响的主要手段是在更可能发生这种错误启动的较低温度下可逆地抑制热稳定聚合酶活性。在将聚合酶反应混合物的温度升高至接近热稳定聚合酶的最佳反应温度的温度时，除去抑制活性并且热稳定聚合酶延伸与底物核酸分子结合的引物。这种可逆地抑制嗜热DNA聚合酶以防止引物在较低温度下延伸的方法被称为“热启动(hot-start)”。

热启动可以通过各种物理、化学或生物化学方法完成。在物理热启动中，DNA聚合酶或DNA聚合酶活性必需的一种或多种反应组分不允许与样品DNA接触，直到反应所需的所有组分都处于高温(Horton，R.M.等人，Biotechniques，16；42-43，1994)。化学热启动是指涉及使用化学上可逆地失活的DNA聚合酶的方法，使得聚合酶在环境温度下被抑制并且在更高温度下最具活性(美国专利号5,773,258和6,183,998)。实现热启动的另一种方法是将DNA聚合酶与抗DNA聚合酶抗体结合，然后将其加入试剂中。抗体在环境温度下抑制聚合酶活性，但在高聚合酶反应温度下，抗体变性并与聚合酶解离，从而激活聚合酶(Sharkey等人，Bio/Technology，12：506-509(1994)；Kellogg等人，Biotechniques，16：1134-1137(1994))。

在环境温度下抑制嗜热DNA聚合酶的另一种方法涉及使用结合至DNA聚合酶并抑制DNA聚合酶的核酸适体(aptamer)(美国专利号6,183,967)。适体是通过除经典Watson-Crick碱基配对之外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力的核酸分子。已经选择并设计了各种适体以显示对热稳定聚合酶的特异性和亲和力，并且已经显示它们能够可逆地抑制聚合酶。与热稳定聚合酶的其他可逆抑制剂一样，设计适体以在环境温度下结合和抑制热稳定聚合酶。随后温度的升高导致适体与热稳定聚合酶解离，以允许在高反应温度下的引物延伸和/或核酸扩增。

当设计及选择用于需要热稳定聚合酶活性的反应的抑制性适体时，重要的是产生在合适的温度范围(例如最佳聚合酶活性的温度范围)内结合并抑制聚合酶的适体，但是在选定的引物与靶核酸底物杂交的温度下，适体也在允许最佳热稳定聚合酶活性的温度下与聚合酶解离。本文描述了适体，其可以形成二级结构，并且可以在依赖于热稳定聚合酶活性的各种测定中减少非特异性聚合酶产物的产生，但是可以与聚合酶解离以促进靶产物的产生和检测。