[发明专利]真菌宿主细胞中DNA片段的基因组整合

说明书

本发明涉及在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括用以下转化该宿主细胞：iv.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；v.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地vi.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小和同源性以实现与该特定靶位点的同源重组，用于染色体整合。

对序列表的引用

本申请含有一个计算机可读形式的序列表。将该计算机可读形式通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及在真菌宿主细胞中的特定染色体靶位点处体内组装和整合目的多核苷酸的方法，所述方法包括用以下转化该宿主细胞：

i.至少一种多核苷酸片段，其依次包含上游侧翼区和该目的多核苷酸的5’部分；

ii.至少一种多核苷酸片段，其依次包含该目的多核苷酸的3’部分和下游侧翼区；和，任选地

iii.一种或多种另外的多核苷酸片段，每种多核苷酸片段包含该目的多核苷酸的5’部分和3’部分；

其中每种多核苷酸片段的5’部分和3’部分与另一片段的一个或多个5’部分和3’部分具有至少20bp的重叠，因此这些片段覆盖整个目的多核苷酸，并且其中这些侧翼区具有足够的大小和同源性以实现与该特定靶位点的同源重组，用于染色体整合。

背景技术

已经披露了用于使用位点特异性重组酶将目的多核苷酸文库重组到丝状真菌宿主细胞的染色体中的方法(WO 2016/026938)。

披露了一种有效的名为双分裂标记系统(DSMS)用于位点特异性和定向染色体整合，其中使启动子以及亚硝酸盐还原酶(niiA)基因和硝酸盐还原酶(niaD)基因二者的5'部分缺失，因此使它们的表达失活，并且其中通过双同源重组(重构这两种基因以允许在用NaNO₃作为唯一氮源的基本培养基上进行选择)整合侧翼为每种基因的互补部分的进入的构建体(Nielsen M.L.等人2006,Efficient PCR-based gene targeting with arecyclable marker for Aspergillus nidulans[针对构巢曲霉的有效的基于PCR的用可再循环标记进行的基因靶向],Fungal Genetics and Biology[真菌遗传学和生物学]第43卷:54-64)。

还披露了用于丝状真菌宿主细胞中的基因文库的位点特异性染色体整合的方法，该方法采用自主复制序列和包含该基因文库的整合盒和名为分裂标记或双分裂标记系统(DSMS)(WO 2015/082535)。

本领域普遍认为，在丝状真菌宿主细胞中，如在曲霉属宿主细胞中，有效同源重组需要至少500bp。因此，习惯上使用重叠延伸剪接(SOE)PCR组装基因文库，然后将其转化至真菌宿主进行整合。

发明内容

本发明提供了用于成功地用2-5个DNA片段(各自具有少至20bp同源重叠)来转化丝状真菌米曲霉宿主细胞的方法，随后这些细胞体内重组，并且位点特异性地被整合至该染色体中。进行了几个若干实验以测试这些具有20-1000bp同源重叠的DNA片段是否可以体内组装。结果示出具有仅20bp重叠的2个片段的组装十分有效。该方法被应用于脂肪酶和核酸酶变体的生成以及脂肪酶编码序列的位点饱和文库生成。还进行了一些实验，成功组装了编码脂肪酶的3个片段。该方法消除了对许多应用(如变体生成、文库生成等)进行克隆或重叠延伸剪接(SOE)PCR组装的需要。