[发明专利]用于检测雌激素受体ESR1突变的多路等位基因特异性PCR测定

说明书

本文提供了检测雌激素受体(ESR1)中的突变的方法和组合物。

发明背景

70%的乳腺癌是雌激素受体(ER)阳性的，尽管这些患者的大多数最初对激素疗法有应答，但是大约20-30%将变成疗法难治的。最近的数据提示在雌激素受体基因(ESR1)中活化突变与抗性有关，所述突变在抗雌激素治疗中获得并且在原发性未治疗的ER阳性乳腺癌中很少发现。已经在来自激素难治的乳腺癌的样品中鉴别出越来越多数目的位于配体结合结构域中的活化ESR1突变，最常见的突变包括K303R、E380Q、V392I、S463P、K531E、V534E、P535H、L536Q/R、Y537S/N/C、D538G和R555C。尽管没有完全阐明所有突变的作用机理，但是体外实验已经证实，在L536Q、Y537S/C/N和D538G中的突变会以活性构象稳定雌激素受体配体结合结构域，因而允许在没有配体存在下募集转录共活化剂。对雌激素的超敏反应被视作K303R突变的机制。

因此ESR1突变的检测具有预测激素抗性和指导疗法的潜力。下一代测序(NGS)是这样的检测的常见方案，因为它能够用少量样品同时检测许多突变。但是，NGS是非常费力的、冗长的和昂贵的。数字PCR (dPCR)代表一种非常灵敏的已经被用于ESR1突变检测的方法，但是它具有许多缺点：dPCR工作流是冗长的且需要特殊设备，并且多路化受限于在当前dPCR仪器上可利用的光学通道的数目。

发明概述

本文提供了用于检测ESR1基因中的突变的试剂盒、测定和方法，以及具有激素敏感癌症的个体的治疗方法。

本文提供了包含一个或多个容器的试剂盒，每个容器容纳两种或更多种引物对，每种引物对是对ESR1基因中的不同序列特异性的；一种或多种对ESR1基因中的不同序列特异性的探针，其中每种探针被标记；对内部对照序列特异性的引物对；和对所述内部对照序列特异性的探针。在某些实施方案中，所述每种探针用荧光团和猝灭剂标记。在某些实施方案中，所述试剂盒包含1-10个容器，例如，2-5、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个容器。在某些实施方案中，每个容器容纳两种或更多种引物对(包括内部对照引物对)，例如，3-16、4-10或5-8种。例如，可以将所有外显子8突变、内部对照和两种或更多种其它突变引物对包括在单个试管中。在某些实施方案中，每个容器容纳3-4种探针(包括内部对照探针)。在某些实施方案中，每个容器进一步容纳热稳定的DNA聚合酶。

在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包括阳性对照，例如，具有已知ESR1突变的样品，和/或阴性对照，例如，不包括ESR1突变的样品。

在某些实施方案中，ESR1基因的每个不同序列选自：ESR1 V422DelV、ESR1 S463P、ESR1 L536H、ESR1 L536P、ESR1 L536Q、ESR1 L536R、ESR1 D538G、ESR1 K303R、ESR1 E380Q、ESR1 L536_D538P、ESR1 Y537C、ESR1 Y537N、ESR1 Y537S、ESR1 S341L、ESR1 L429V、ESR1V533M、ESR1 V534E和ESR1 P535H。在某些实施方案中，所述试剂盒包括至少两种引物对，其选自：对ESR1 V422DelV特异性的引物对、对ESR1 S463P特异性的引物对、对ESR1 L536H特异性的引物对、对ESR1 L536P特异性的引物对、对ESR1 L536Q特异性的引物对、对ESR1L536R特异性的引物对、对ESR1 D538G特异性的引物对、ESR1 K303R、对ESR1 E380Q特异性的引物对、对ESR1 L536_D538P特异性的引物对、对ESR1 Y537C特异性的引物对、对ESR1Y537N特异性的引物对、对ESR1 Y537S特异性的引物对、对ESR1 S341L特异性的引物对、对ESR1 L429V特异性的引物对、对ESR1 V533M特异性的引物对、对ESR1 V534E特异性的引物对和对ESR1 P535H特异性的引物对。在某些实施方案中，至少一种引物包括经修饰的非天然存在的核苷酸。