[发明专利]改进的基因编辑

说明书

本发明总体上涉及用于控制基因表达的系统、方法和组合物，涉及序列打靶，诸如基因组微扰或基因编辑，其可以使用与重组酶和规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及其组分相关的载体系统。

技术领域

本发明总体上涉及用于控制基因表达的系统、方法和组合物，涉及序列打靶，诸如基因组微扰或基因编辑，其可以使用与重组酶和规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及其组分相关的载体系统。

背景技术

基因组编辑是一项功能强大的技术，它可以特异性地并通常精准地添加或去除遗传物质。基因组编辑通过在目标细胞中使双链DNA断裂来启动。可通过以下几种方法造成这些双链DNA断裂——包括：大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALE-核酸酶和/或CRISPR/Cas9限制性修饰系统。这些系统中每个都在使用者指定的基因组位置造成dsDNA断裂。在造成dsDNA断裂之后，细胞机构立刻做出反应，通过非同源末端连接(NHEJ)途径或通过同源重组(HDR)途径来修复此dsDNA。尽管NHEJ途径有效地修复了此断裂，但修复经常是不完全的，导致插入和缺失。如果由NHEJ修复所造成的这些插入和缺失发生在开放读码框内，则最常见的结果是移码突变。这种移码常常导致该特定基因失活。通过HDR途径修复dsDNA断裂不仅可以得到精准的修复，还可允许引入实验设计的基因组元件。许多疾病的修正、成功的基因治疗都可以通过使用HDR来迫使细胞修正dsDNA断裂来实现。对于基因治疗研究人员、临床医师和患者来说不幸的是，大多数人类细胞强烈倾向于以容易出错的NHEJ途径修正dsDNA断裂，而不是以更精准的HDR途径。使用内源性细胞机构，95％的dsDNA断裂是使用NHEJ修复的，而只有5％的dsDNA断裂使用HDR修复。这一统计数据代表的是最好的情况；许多细胞类型完全缺乏HDR机制，因而没有使用精准的HDR通路进行的修复。为了使精准的基因治疗成功，必须改进细胞使用HDR途径的能力。

发明内容

本发明的发明人已开发出一种结合诸如CAS-CRISPR基因编辑的技术的方法，其显著提高细胞利用HDR途径的能力。本文示出的数据表明，该系统可以使细胞对dsDNA修复途径的偏好从容易出错的NHEJ途径向HDR途径倾斜——改进幅度在5和125倍之间。这种在HDR上的改进通过添加病毒和/或细菌重组酶——UvsX或RecA(来自大肠杆菌(E.coli)或肺炎链球菌(S.Pneumoniae))来实现。这些重组酶的表达结合位点特异性核酸酶和同源重组(HR)底物可实现改进的HDR，并在没有HDR机制的细胞中允许进行HDR。

HDR介导的dsDNA修复的这种改进不仅在研究应用中具有重大意义，在基因治疗中也具有重大意义。该技术将在基础研究实验室中得到迅速应用。在不久的将来，该技术可以用于重新激活在诸如戈谢(Gauchers)病、法布里(Fabry)病和庞贝(Pompe)病的许多代谢性疾病中缺乏的酶。目前，这些疾病通过酶替代疗法(ERT)治疗。ERT通常极其昂贵(每年200,000美元)且需要定期注射。此外，这些治疗可能导致不期望的免疫反应。例如，庞贝病(糖原贮积病II型)是由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的缺陷复制引起的。最常见的GAA的这种缺陷复制是由单个胸腺嘧啶到鸟苷的颠换造成的。由于注射重组GAA能显著改善患者的生命，因而使用我们的技术来忠实地修正小部分庞贝病患者细胞中的此突变将允许活性GAA的分泌。这种基因改变不仅可以节省大量费用，而且可以显著改善庞贝病患者的预后。可以使用我们的技术引入类似的基因疗法来治疗目前依赖于ERT的患者。

这些疾病使患者衰弱且治疗这些疾患是昂贵的。尽管ERT在减轻痛苦方面效果良好，但由于ERT费用太过高昂，一些政府和医疗保险提供商拒绝对它们进行担保。我们的基因替代技术一旦完全开发出来将会产生与ERT类似的效果，而不需要终生输注，且只需花费小部分的费用。虽然我们改进HDR的工作还处于早期阶段，但我们已经成功地表明我们的技术相比目前技术要好许多倍；因此，现在是向我们的项目投入资源的时候了；该项目一旦成功将立即改善无数人的生活。