[发明专利]使用E-钙粘蛋白结合型核酸适配体的细胞支架材料

说明书

本发明提供使用了核酸适配体的细胞培养用支架材料，所述核酸适配体是能够化学合成、不含动物来源成分、生物相容性高的材料。细胞支架材料，其含有E‑钙粘蛋白结合型核酸适配体。

技术领域

本发明细胞涉及细胞支架材料，其含有能够与作为细胞粘附因子的E-钙粘蛋白(E-cadherin)特异性结合的核酸。

背景技术

细胞的增殖、生理功能、分化能力根据存在于细胞表面的粘附蛋白与其配体的结合而变化是已知的(非专利文献1)。因此，若能够获得与细胞表面蛋白质牢固地结合的、可进行化学修饰的分子组，向细胞提供非天然型的高度结合方式，则可期待构建能够不导入基因而安全且简便地改善细胞功能的新方法理论。

细胞的功能受到培养环境很大影响是已知的。其中，细胞与基材表面的粘附、以及细胞之间的粘附会大大影响细胞的增殖、分化。例如，为了向基材表面赋予细胞粘附能力，实施了用纤连蛋白、胶原蛋白等蛋白质、以及作为纤连蛋白的整合素结合位点的RGD肽对基材表面进行修饰等手段。

近年来，为了在单层状态下维持干细胞的分化能力，提出了利用固定化有E-钙粘蛋白的基材表面的方案。使用明胶包被板或支承细胞层(饲养细胞层)培养的ES细胞通过介由E-钙粘蛋白的细胞-细胞粘附(Cell-Cell adhesion)而形成紧密凝聚的集落(非专利文献2)。长冈等人发现，在用E-钙粘蛋白与免疫球蛋白(IgG)的Fc结构域形成的融合蛋白(ECad-Fc)包被的板上培养小鼠的ES细胞时，细胞间不接触，不形成集落。如此培养的细胞在长期培养后仍然维持用于分化成全部三种胚层细胞的多分化能力、和包括种系传递在内的全部ES细胞功能，具有比形成集落的状态更高的增殖能力(非专利文献3)。

一般而言，使用动物来源成分进行细胞培养。通常，培养用培养基成分中含有5～10％左右的血清，进而，为了提高存活率、增殖率、分化，添加特定种类的蛋白质。这些血清、蛋白质成分为动物来源成分。另外，被期待作为再生医疗、药效、毒性评价等的工具利用的人多能干(iPS)细胞(非专利文献4)是利用作为饲养细胞的来自小鼠胚胎的成纤维细胞、或基质胶(Matrigel)(来自小鼠肉瘤的基底膜基质)等源于动物成分的的支架材料培养的(非专利文献5)。这些培养中利用了细胞-基质粘附(cell-substratum adhesion)，而非细胞-细胞粘附。

上述人iPS细胞用支架材料包含各种不确定因素，因此，不仅担心临床应用中的安全性，而且由于含有许多动物来源成分故而需要考虑制造商、批次之间的重现性。另外，为了维持人iPS细胞的未分化、阐明分化中的分子机制，也期望构建不含不确定因素的、全部由已知组成构成的非动物来源成分(Xeno-free(无异源))的支架材料。

核酸适配体是具有分子识别能力的单链DNA/RNA，鉴于其结构多样性，已经报道了大量与小分子、蛋白质、细胞等各种靶标具有高结合能力的核酸适配体，作为替代抗体的新型分子识别元件而受到关注(非专利文献6)。核酸适配体是具有能够在不利用生物的情况下筛选、能够向任意部位导入化学修饰、可容易进行核酸适配体之间的连接、热稳定性及保存性高等抗体所不具有的诸多特长的生物体高分子。核酸适配体是能够化学合成、不含动物来源成分、且生物相容性高的材料。

鉴于上述特征，通过将核酸适配体作为非动物来源成分(Xeno-free)的支架材料，能够确保在生物体外培养的细胞、组织的均匀性，同时可安全地利用。例如，认为能够解决现有的人iPS细胞培养用支架材料的问题点，即对于临床应用中安全性的担心、由制造商或批次间导致的重现性的降低。另外，就利用了核酸适配体的支架材料而言，可期待能够通过核酸酶处理在不对细胞表面蛋白质造成损伤的情况下系统性地回收培养细胞。另一方面，迄今为止报道了多种与各种靶标结合的核酸适配体，但并未报道核酸适配体单体诱导细胞粘附、及作为支架材料应用的例子。