[发明专利]半胱氨酸工程化III型纤连蛋白结构域结合分子

权利要求书

1. 一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含在选自FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的至少一个半胱氨酸取代，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1。

2. 根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半胱氨酸取代位于选自SEQ ID NO:111-114或122-137的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处。

3. 一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合。

4. 一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

5.根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其还包含半衰期延长部分。

6.根据权利要求5所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半衰期延长部分为结合白蛋白的分子、聚乙二醇(PEG)，或免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。

7.一种制备经半胱氨酸改造的FN3结构域的方法，其包括：

(i) 通过用编码半胱氨酸氨基酸残基的核苷酸残基替换一个或多个核苷酸残基来诱变亲本FN3结构域的核酸序列，以编码所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；

(ii) 表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；以及

(iii) 回收所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。

8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1，并且所述诱变步骤包括进行定点诱变。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括在大肠杆菌(E.coli)中表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。

10.根据权利要求8所述的方法，其还包括在所述回收步骤之后：将所述经半胱氨酸改造的FN3结构域与硫醇反应性化学试剂反应，以生成化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域。

11.根据权利要求10所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的EGFR结合。

12.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量EGFR过表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。

13.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的c-Met结合。

14.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量c-Met表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。