[发明专利]用于测定转染的装置和方法

说明书

本发明涉及一种用于测定细胞或细胞组的转染的体外方法，其中所述测定通过光谱进行。测定包括借助拉曼光谱法记录细胞或细胞组的至少一个拉曼光谱。此外，本发明涉及用于测定细胞或细胞组的转染的装置，其中所述装置包括作为第一单元(i)的显微镜系统，以可视化细胞；作为第二单元(ii)的拉曼光谱系统，以记录细胞或细胞组的拉曼光谱；和作为第三单元(iii)的评估模块，其与拉曼光谱系统连接并且其配置为借助记录的拉曼光谱来测定细胞或细胞组是否已经被转染。使用主成分分析公开了拉曼光谱数据的统计分析。在PCA得分图中，可以看到转染样品与对照样品在PC‑1轴上不同。

技术领域

本发明涉及用于测定细胞或细胞组(group of cells)的转染的体外方法，其中所述测定通过光谱进行。该测定包括借助拉曼光谱法记录细胞或细胞组的至少一个拉曼光谱。此外，本发明涉及用于测定细胞或细胞组的转染的装置，其中所述装置包括作为第一单元(i)的显微镜系统，以使细胞可视化；作为第二单元(ii)的拉曼光谱系统，以记录细胞或细胞组的拉曼光谱；以及作为第三单元(iii)的评估模块，其与拉曼光谱系统连接并且其配置为借助记录的拉曼光谱来测定细胞或细胞组是否已经被转染。

背景技术

转染是将外来核酸引入细胞以产生遗传改性的细胞的过程。取决于遗传物质的性质，引入的遗传物质(通常是DNA或RNA)稳定地或短暂地存在于细胞中(Recillas-Targa，2006，Mol Biotechnol 34(3)，337-354)。已经开发了几种转染方法。它们大致可分为生物、化学和物理介导的方法。最常用的生物学方法是病毒介导的转染(或转导)，该方法是高效的，因为病毒整合到宿主基因组中。该转染方法的主要缺点是免疫原性和细胞毒性。化学转染方法是使用最广泛和最流行的转染方法。通常，这些方法利用阳离子聚合物、磷酸钙、阳离子脂质和阳离子氨基酸。这些方法的原理相似：带正电荷的化学物质与带负电荷的核酸复合，导致整体带正电荷的化学物质/核酸复合物被带负电荷的细胞膜吸引。引入细胞的机制被认为包括内吞作用和吞噬作用。这些方法的转染效率似乎取决于因素例如核酸/化学物质比例、溶液pH和细胞膜条件。与病毒介导的方法相比，效率更低但细胞毒性也更低且没有诱变风险(Kim和Eberwine，2010，Anal Bioanal Chem，397，3173-3178)。物理转染方法使用多种物理工具来递送核酸。这些方法尤其包括直接微注射(direct micro injection)、显微注射和基因枪(biolistic particle delivery)、电穿孔和基于激光的转染。在这些方法中，电穿孔是使用最广泛的方法。虽然电穿孔的确切机制仍然是未知的，但是认为短的电脉冲干扰细胞膜并在细胞膜中产生孔，核酸可以通过孔(Inoue和Krumlauf，2001，NatNeurosci 4，1156-1158)。物理转染方法组中相对新增加的方法是超声介导的转染。该方法利用治疗超声(TUS)，其被证明将基因安全地递送到细胞和细胞核中。TUS似乎是像机械力一样运作，将核酸递送通过细胞质网络并进入细胞核(Haber等，2017，ScientificReports，7，42046)。

转染后通常的转染工作流程包括铺板转染的细胞，回收(recovery)和生长阶段以及分析步骤，分析步骤可以基于蛋白质表达，因此涉及蛋白质印迹分析，报告基因活性分析或显微分析，例如以荧光蛋白为基础。或者，分析步骤可以基于基因表达，因此涉及流式细胞术或实时pPCR。因此，这些方法通常涉及使用报告或标记基因/蛋白。例如，通过计数具有绿色荧光蛋白(GFP)的转染细胞以及在荧光板读数器记录的图像中Hoechst染色的细胞核，标准荧光定向转染效率测定方法基于计算转染细胞占所有细胞的百分比(Sandbichler等，2013，Biores Open Access，2(1)，20-27)。该方法涉及在新鲜的生长培养基上24小时的再生期。在另一种方法中，可以使用流式细胞术测定阳性转染细胞的百分比，例如，基于GFP信号(Keith等，2000，BioTechniques，28，148-154)。同样在该方法中，需要约1天的再生阶段。其他的方法基于使用抗生素抗性，其也需要细胞在合适的培养基上的生长期。