[发明专利]用于海藻宿主细胞的CRISPR-Cas系统在审

专利信息
申请号: 201780055558.1 申请日: 2017-07-13
公开(公告)号: CN109689856A 公开(公告)日: 2019-04-26
发明(设计)人: J·C·利普梅尔;Y·贝茨;J·A·柔布斯;R·沃瓦尔 申请(专利权)人: 帝斯曼知识产权资产管理有限公司
主分类号: C12N1/10 分类号: C12N1/10;C12N15/11;C12N15/79
代理公司: 北京坤瑞律师事务所 11494 代理人: 封新琴
地址: 荷兰*** 国省代码: 荷兰;NL
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摘要:
搜索关键词: 宿主细胞 细胞生物学领域 分子生物学 海藻 菌纲
【权利要求书】:

1.一种非天然存在的或工程化的组合物,其包含CRISPR-Cas系统的来源,所述CRISPR-Cas系统包含引导多核苷酸和Cas蛋白,其中所述引导多核苷酸包含引导序列,所述引导序列基本上为宿主细胞中靶多核苷酸的反向互补物,且所述引导多核苷酸可指导Cas蛋白在所述宿主细胞中靶多核苷酸处的结合以形成CRISPR-Cas复合物,其中所述引导序列基本上是所述宿主细胞的基因组中的5′-(N)yPAM-3′多核苷酸序列靶物的(N)y部分的反向互补物,其中y是8-30的整数,其中PAM是前间区序列邻近基序,其中所述宿主细胞是网粘菌纲(Labyrinthulomycete),优选破囊壶菌目(Thraustochytriales)的成员,优选破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)成员,更优选选自下组的菌属的成员:Aurantiochytrium、Oblongichytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia),甚至更优选裂殖壶菌属菌种ATCC#20888,且其中PAM优选为选自下列的序列:5′-XGG-3′、5′-XGGXG-3′、5′-XXAGAAW-3′、5′-XXXXGATT-3′、5′-XXAGAA-3′、5′-XAAAAC-3′,其中X可为任何核苷酸或其类似物,优选地,X可为任何核苷酸;且W是A或T。

2.根据权利要求1的组合物,其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码和/或所述引导多核苷酸由多核苷酸编码或存在于多核苷酸上。

3.根据权利要求1或2的组合物,其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码和/或所述引导多核苷酸由另一个多核苷酸编码或存在于另一个多核苷酸上,且所述多核苷酸包含在载体中。

4.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中所述引导多核苷酸由多核苷酸编码,所述多核苷酸被转录以提供实际的引导多核苷酸。

5.根据权利要求1-3中任一项的组合物,其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码,且所述引导多核苷酸由另一个多核苷酸编码或存在于另一个多核苷酸上且所述多核苷酸包含在一个载体中。

6.根据权利要求1-3中任一项的组合物,其中所述Cas蛋白由包含在载体中的多核苷酸编码,且所述引导多核苷酸由包含在另一个载体中的另一个多核苷酸编码,或存在于包含在另一个载体中的另一个多核苷酸上,其中,优选地,编码所述Cas蛋白的载体由低强度启动子驱动,且编码所述引导多核苷酸的载体由高强度启动子驱动。

7.根据权利要求6的组合物,其中一个或多个或全部载体包含选择性标记,优选每个载体包含不同的选择性标记。

8.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中一个或多个外源多核苷酸可操作地连接至所述引导多核苷酸。

9.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中所述Cas蛋白包含至少一个核定位序列,优选异源核定位序列。

10.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中所述Cas蛋白具有在所述靶序列的位点处直接剪切两个多核苷酸链的活性。

11.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中所述Cas蛋白编码多核苷酸是针对所述宿主细胞密码子优化的,优选密码子对优化。

12.根据前述权利要求中任一项的组合物,其中所述引导多核苷酸由多核苷酸编码,所述多核苷酸可操作连接至RNA聚合酶II或III启动子,优选连接至网粘菌纲EF-1启动子。

13.根据权利要求1-12中任一项的组合物,其中可操作地连接至RNA聚合酶II启动子的多核苷酸编码包含所述引导多核苷酸和自处理核酶的前引导多核苷酸,其中,当转录时,所述引导多核苷酸通过自处理核酶从前引导多核苷酸转录物中释放。

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