[发明专利]用于进行多重实时PCR的方法

权利要求书

1.用于扩增和检测样品中的靶核酸的方法，其包括以下步骤：

(a) 使含有所述靶核酸的所述样品在单个反应容器中与以下接触：

(i) 一对寡核苷酸引物，每个寡核苷酸引物能够与所述靶核酸的子序列的相反链杂交；

(ii) 寡核苷酸探针，其包含退火部分和标签部分，其中所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列或非核苷酸分子，其中所述退火部分包含与所述靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并杂交至由所述对寡核苷酸引物界定的所述靶核酸的所述子序列的部分，其中所述探针还包含相互作用的双重标记，其包含位于所述标签部分或所述退火部分上的报告子部分和位于所述退火部分上的第一猝灭剂部分，并且其中通过核酸酶敏感的切割位点将所述报告子部分与所述第一猝灭剂部分分离；且其中所述标签部分以温度依赖性方式可逆地结合至猝灭分子，所述猝灭分子包含一个或多个猝灭剂部分或与一个或多个猝灭剂部分结合，当所述猝灭分子与所述标签部分结合时，所述一个或多个猝灭剂部分能够猝灭所述报告子部分；

(b) 使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过PCR扩增所述靶核酸，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，聚合酶的核酸酶活性允许从探针的退火部分上的第一猝灭剂部分切割和分离标签部分；

(c) 在猝灭分子与标签部分结合的第一温度下测量来自报告子部分的抑制信号；

(d) 将温度升高到猝灭分子不与标签部分结合的第二温度；

(e) 在第二温度下测量来自报告子部分的温度校正信号；

(f) 通过从在第二温度下检测到的温度校正信号中减去在第一温度下检测到的抑制信号，获得计算信号值；

(g) 通过多个PCR循环重复步骤(b)至(f)；

(h) 测量来自多个PCR循环的计算信号值以检测靶核酸的存在。

2.权利要求1的方法，其中所述报告子部分位于所述寡核苷酸探针的标签部分上或所述寡核苷酸探针的退火部分上。

3.权利要求1或2的方法，其中所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并且所述猝灭分子是包含与所述寡核苷酸探针的标签部分至少部分互补的核苷酸序列的寡核苷酸，并通过杂交与所述标签部分结合。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述标签部分包含修饰，使得其不能被核酸聚合酶延伸。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针的标签部分或所述猝灭分子或所述标签部分和所述猝灭分子两者含有一种或多种核苷酸修饰。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥连核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-对映体核苷酸，或其组合。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述报告子部分是荧光染料，并且所述猝灭剂部分猝灭来自所述荧光染料的可检测信号。