[发明专利]单核苷酸检测方法及相关的探针

权利要求书

1.一种核酸测序方法，其特征在于以下步骤：(1)通过逐步酶消化核酸生成单核苷三磷酸流；(2)通过在聚合酶和连接酶存在下，使至少一个单核苷三磷酸与相应的初级探针反应，产生至少一个基本上双链的初级寡核苷酸占用探针，所述初级探针包含(a)第一单链寡核苷酸，其包含第一限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获所述单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点和并置于所述捕获位点任一侧的寡核苷酸侧翼区，和(b)能够与第一寡核苷酸侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；(3)用第一切口限制性核酸内切酶在第一切口位点切割占用初级探针的第一寡核苷酸链，以产生分离的第一寡核苷酸组分；(4)将步骤(3)中产生的第一寡核苷酸组分与占用探针的互补链分离；(5)通过在连接酶存在下使至少一个分离的第一寡核苷酸组分与相应的二级探针反应产生至少一个基本上双链的二级占用探针，所述二级探针包含(c)包含第二限制性核酸内切酶切口位点并带有基本上不可检测状态的荧光团的互补第四寡核苷酸，和任选的(d)至少部分与第四寡核苷酸互补的单链第五寡核苷酸；(6)用第二切口限制性核酸内切酶切割占用二级探针的第四寡核苷酸链，以产生分离的第四寡核苷酸组分，其中至少一些具有可检测状态的荧光团和至少部分为第四寡核苷酸的互补序列的单链第六寡核苷酸；和(7)检测步骤(6)中释放的荧光团。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)在第一个循环中重复。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中产生的第六寡核苷酸与另一第四寡核苷酸分子反应，然后重复步骤(6)以产生第二个循环。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，第四寡核苷酸还包含至少一个猝灭剂。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，第二寡核苷酸和第三寡核苷酸通过寡核苷酸接头区连接。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，占用初级探针的互补链包括闭环。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一切口位点是包括所述捕获位点的寡核苷酸区域。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，第一和第二切口限制性核酸内切酶相同。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，第一和第二切口限制性核酸内切酶中的一个或两个是常规的限制性核酸内切酶，并且与被切割的链互补的占用初级探针和/或二级占用探针的链对核酸内切具有抗性。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，采用多达四种不同的二级探针类型，每种二级探针的第四寡核苷酸具有不同的荧光团和与不同的第一寡核苷酸组分互补的区域。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，使用多达四种不同的初级探针类型，每种初级探针的第一寡核苷酸具有对天然存在的DNA或RNA的特征性核碱基之一具有选择性的捕获位点和任选的基本上不可检测状态的不同荧光团。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)还包括在相应的微滴中含有每种单核苷三磷酸，并且步骤(2)-(7)在每个微滴中进行或在每个微滴上进行。

13.一种多组分生物探针系统，其特征在于，包括(1)初级探针，其包含(a)第一单链寡核苷酸，其包含第一限制性核酸内切酶切口位点、用于捕获单核苷三磷酸的单核苷酸捕获位点和并置于第一捕获位点任一侧的寡核苷酸侧翼区，和(b)能够与所述侧翼区杂交的第二和第三单链寡核苷酸；和(2)二级探针，其包含(c)至少部分单链的第四寡核苷酸，其带有基本上不可检测状态的荧光团，具有与第一寡核苷酸的至少一部分互补的单链区域，并包括第二限制性核酸内切酶切口位点；和(d)任选的单链第五寡核苷酸，其至少部分地与所述第四寡核苷酸互补。