[发明专利]人类耳祖细胞鉴定和分离

说明书

本发明主要涉及人耳祖细胞的鉴定和分离。更具体地，本发明涉及使用细胞标志物从混合细胞群中鉴定和分离人耳祖细胞的方法、富集和产生人耳祖细胞的方法以及用于鉴定和/或分离人耳祖细胞的相关试剂盒，其中细胞标志物选自SSEA1(CD15)、二唾液酸神经节苷脂GD3、TRA‑2‑49(肝/骨/肾碱性磷酸酶)、SSEA4、神经节苷脂GD2和CD141。

本发明主要涉及人耳祖细胞的鉴定和分离。更具体地，本发明涉及使用细胞标志物从混合细胞群中鉴定和分离人耳祖细胞的方法、富集和产生人耳祖细胞的方法以及用于鉴定和/或分离的相关试剂盒。

耳聋是一种在世界范围内具有高发病率的病症，主要由感觉毛细胞及其相关螺旋神经节神经元(SGN)的丧失产生。在所有耳聋形式中，听神经病变尤其令人担忧。这种病况主要由SGN的损伤引起，毛细胞相对保留，这种病况是造成大部分听力损伤患者的原因。尽管可以通过人工耳蜗部分地克服毛细胞的丧失，但是没有常规治疗可用于感觉神经元丧失，因为差的神经支配限制了植入物的预期性能。使用干细胞来恢复受损的感觉回路是一种潜在的治疗策略。

已经开发了使用参与初始规范耳基板的信号(例如FGF3和FGF10)来诱导从人胚胎干细胞(hESC)分化的方案(Chen等人2012.Restoration of auditory evoked responsesby human ES-cell-derived otic progenitors.Nature,490(7419):278-82.doi:10.1038/nature11415)。所诱导的耳祖细胞能够在体外分化成毛细胞样细胞和显示预期电生理特性的听觉神经元。此外，当移植到听神经病模型中时，耳神经祖细胞植入、分化并显著改善听觉诱发的反应阈值。然而，所使用的FGF3/10诱导方法效率低，仅产生约20％的所需细胞类型。

如果来源于人胚胎干细胞(hESC)的耳祖细胞用于临床环境，则必须从分化过程中无意中产生的其他细胞类型中分离这些细胞。从异质培养物中分离出组分细胞群的既定方法是荧光激活细胞分选(FACS)，但是为了使用该方法，必须鉴定出与关键细胞类型(例如耳祖细胞)结合的特异性细胞表面标志物。尽管已经描述了多种标志物来分离一般神经祖细胞，但尚未鉴定出分离人耳祖细胞(神经或上皮细胞)的标志物。

本发明的一个目的是提供一种从混合细胞群中鉴定和可能地分离人耳祖细胞的方法。

发明内容

根据本发明的第一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其使用至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1(也被称为CD15或Lewis x)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141。

根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141。

根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其包括确定细胞是否具有至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2和CD141，

其中被鉴定为具有以下的细胞被鉴定为人耳祖细胞：

a)SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4或GD2中的至少两种；或者

b)SSEA1、GD3、TRA-2-49、SSEA4、GD2中的至少一种，而无CD141。

根据本发明的另一方面，提供了一种鉴定混合细胞群中的人耳祖细胞的方法，其使用至少两种选自以下的细胞表面标志物：SSEA1(也被称为CD15)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141，所述方法包括：

-提供对至少两种不同细胞标志物(即至少两种选自以下的不同细胞标志物：SSEA1(也被称为CD15)、GD3、TRA-2-49(碱性磷酸酶)、SSEA4、GD2和CD141)特异的结合成员；