[发明专利]设计者α1;6-岩藻糖苷酶突变体实现完整N-糖肽和N-糖蛋白的直接核心岩藻糖基化

说明书

本发明提供新的岩藻糖苷酶突变体，其作为岩藻糖‑连接酶起作用，用于包括完整的治疗性抗体在内的多种生物学糖肽和糖蛋白的核心岩藻糖基化。在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)α1,6‑岩藻糖苷酶的广义酸/碱残基E274处具有突变的几种突变体，包括E274A、E274S、和E274G，能够有效地使多种复杂的N‑糖肽和完整糖蛋白岩藻糖基化。所述位点特异性突变体能够将岩藻糖转移至核心GlcNAc‑Asn残基并可用于药物递送和疫苗开发。

本发明中的政府权益

本发明是在美国国家卫生研究所以资助号R01GM080374D授予的政府支持下做出的。美国政府在本发明中享有某些权益。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月10日提交的共同待决美国临时申请号62/373151的优先权，所述申请的内容由此通过引用并入本文中，用于所有目的。

发明背景

技术领域

本发明提供新的岩藻糖苷酶突变体，其作为用于包括完整的治疗性抗体在内的多种生物学糖肽和糖蛋白的核心岩藻糖基化的岩藻糖-连接酶起作用。位点特异性突变体能够将岩藻糖转移至核心GlcNAc-Asn残基并可用于药物递送和疫苗开发。

相关技术

天冬酰胺-连接的糖基化作用，即N-糖基化，是哺乳动物中最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，其在调节基础蛋白质的固有性质和生物学功能中起到重要的作用^1,2。例如，连接的N-聚糖可以对蛋白质的折叠、稳定性、抗原性和免疫原性产生深刻的影响^2,3。另一方面，N-聚糖可以直接参与各种生物学识别过程，包括细胞粘着、宿主-病原体相互作用、癌症转移和免疫应答^1,4-9。尽管所有哺乳动物N-聚糖共享共同的低聚糖核心结构，但是该核心的进一步装饰，例如唾液酸化和岩藻糖基化，在调节生物学功能方面增加了另一水平的结构多样性。

N-聚糖中的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分是一种重要的N-糖蛋白修饰。已有令人信服的数据表明糖蛋白的核心-岩藻糖基化调节各种细胞功能。例如，许多研究已经揭示了增加的核心岩藻糖基化经常与癌症进展有关^10-12。AFP-L3，作为核心-岩藻糖基化的甲胎蛋白，已经被管理机构批准作为肝细胞癌——肝癌的主要形式的生物标志物¹³。已经通过实验证明了核心-岩藻糖基化在发育中的作用—在小鼠模型中敲除FUT8基因诱导了出生后发育过程中严重的生长停滞和死亡¹⁴。核心岩藻糖基化还直接调节糖蛋白的生物学活性，例如治疗性单克隆抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)¹⁵，生长因子受体和粘着分子的信号传导功能^14,16-20和IgG B细胞受体的抗原识别²¹。另一方面，结构研究提示，核心-岩藻糖基化可以显著地影响N-聚糖的构象^22,23。