[发明专利]用于修饰基因组DNA的方法和组合物

权利要求书

1.用于细胞中的靶基因组DNA区域的位点特异性序列修饰的方法，其包括：

用组合物通过电穿孔转染所述细胞，所述组合物包含(a)DNA寡核苷酸；(b)DNA消化剂；和(c)靶向RNA，其中所述靶向RNA是加帽的和/或多腺苷酸化的；

其中所述DNA寡核苷酸包含：

(i)包含与所述靶基因组DNA区域同源的DNA序列的同源区域；和

(ii)序列修饰区域；并且

其中所述基因组DNA序列在所述靶基因组DNA区域特异性修饰。

2.权利要求1所述的方法，其中电穿孔是使用流式电穿孔装置的流式电穿孔。

3.权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述DNA消化剂是核酸酶。

4.权利要求3所述的方法，其中所述核酸酶包含Cas9。

5.权利要求3至4中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是位点特异性核酸酶。

6.权利要求5所述的方法，其中所述靶向RNA包含指导RNA。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA是加帽的和多腺苷酸化的。

8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述靶向RNA在体外加帽和多腺苷酸化。

9.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是单链的。

10.权利要求9所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸和靶向RNA与所述靶基因组DNA区域的相同链互补。

11.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是多于10个核酸。

12.权利要求11所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至800个核酸。

13.权利要求12所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至600个核酸。

14.权利要求13所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至200个核酸。

15.权利要求14所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至100个核酸。

16.权利要求15所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸是10至50个核酸。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度大于10μg/mL。

18.权利要求17所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约10至约500μg/mL。

19.权利要求18所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约35至约300μg/mL。

20.权利要求19所述的方法，其中所述组合物中所述DNA寡核苷酸的浓度为约35至约200μg/mL。

21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述组合物是非病毒的。

22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

23.权利要求22所述的方法，其中所述细胞是人细胞。

24.权利要求22所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。