[发明专利]季铵阳离子和叔铵阳离子洗涤剂在蛋白变性中的应用

说明书

本发明涉及包含季铵阳离子或叔铵阳离子的铵阳离子洗涤剂可用作使蛋白质变性的洗涤剂，并且尤其可用于在酶促去糖基化之前使糖蛋白或糖肽变性。具有硫酸根或磺酸根阴离子的铵阳离子洗涤剂是尤其有用的。

相关文献的交叉引用

本申请要求2016年8月17日提交的美国临时专利申请62/376,342的权益。该申请的内容通过引用并入本文并用于所有目的。

联邦资金的声明

不适用。

技术领域

本发明涉及分析糖蛋白的糖基化的领域。

背景技术

许多由真核细胞产生的蛋白质在翻译后由于增加了共价连接的直链或支链的糖链而被修饰。这些蛋白质-糖类偶联物被称为糖蛋白；糖类的结合点称为糖基化位点。所结合的多糖或寡糖称为聚糖。在特定糖蛋白的不同糖基化位点上发现了多种聚糖。特定糖蛋白上的聚糖的特定模式决定于产生该蛋白质的特定细胞系和该细胞生长的条件。

由于与蛋白质偶联的聚糖会影响对该蛋白质功能至关重要的特征，包括药代动力学、稳定性、生物活性或免疫原性，所以在许多应用中确定存在哪些聚糖是重要的。因此，从蛋白质中除去一些或所有聚糖并且对聚糖或蛋白质进行分析或者对聚糖和蛋白质进行分析以确定其组成的能力对于确定蛋白是否具有其预期效果是有用的。例如，美国食品和药物管理局要求对结合至生物制剂(诸如治疗性糖蛋白和疫苗)的糖类进行表征以显示物质组成和制造的一致性，从而需要对产品进行广泛表征。对释放的糖类的曲线分析对于重组蛋白质生产中的质量控制也是重要的，其中糖类曲线中的变化可以预示系统中的压力，信号条件，其可能需要丢弃昂贵蛋白质的商业规模发酵罐。

用于分析聚糖的技术复杂、繁冗并且通常是耗时的。在能够进行分析之前，必须从蛋白质中释放或除去聚糖，这一过程被称为“去糖基化”。进一步地，待分析的样品通常包括细胞裂解物、细胞培养物上清液，以及临床血浆或血清样品，其除感兴趣的糖蛋白之外可以包含多种糖蛋白。因此，希望分析与特定的糖蛋白(诸如用于人类治疗用途的抗体)结合的糖类的公司，通常首先必须进行多个步骤以将目标糖蛋白与原始样品中的其他糖蛋白分离。

只有一部分蛋白质可以在天然或非变性条件下去糖基化，其中将蛋白质与能够从蛋白质中释放出与蛋白质偶联的聚糖的酶进行简单混合。这些方法具有的优点是条件温和且清除简单，但通常导致聚糖的不完全释放。然而，对于大多数通过酶促消化而去糖基化的蛋白质，蛋白质的二级和三级结构使得酶无法接触糖类，除非蛋白质首先变性而改变那些结构。传统的变性方案涉及使用洗涤剂和还原剂，并过夜孵育。例如，这些方案通常将还原剂(诸如β-巯基乙醇)、阴离子洗涤剂(诸如十二烷基(月桂基)硫酸钠)、非离子型洗涤剂(诸如辛基酚聚(乙二醇醚))和去糖基化酶加入至糖蛋白中，并将得到的混合物在37℃孵育16小时。一旦蛋白质去糖基化，立即除去聚糖并通常进行标记。这些方案是有效的，并且在很大程度上独立于蛋白质(也就是说，它们可以用于大多数蛋白质)，但是很苛刻，通常在进行某些分析过程之前必须除去使用的洗涤剂，并且可有许多清除步骤。

在商业细胞培养环境中，当使用这些标准去糖基化方法时，样品处理的时长(通常至少一天)降低了使用糖类分析作为快速过程中分析的标志物以及作为过程变量(诸如细胞培养过程中的压力)控制工具的可能性。因为释放的聚糖中任何洗涤剂的残留都会干扰质谱分析或用于分析糖类曲线的其他技术的结果，所以洗涤剂的使用增加了步骤和时间。