[发明专利]可编程CAS9-重组酶融合蛋白及其用途在审
| 申请号： | 201780062152.6 | 申请日： | 2017-08-09 |
| 公开（公告）号： | CN109804066A | 公开（公告）日： | 2019-05-24 |
| 发明（设计）人： | D.R.刘;B.柴金德;J.L.贝森 | 申请（专利权）人： | 哈佛大学的校长及成员们 |
| 主分类号： | C12N9/22 | 分类号： | C12N9/22;C12N15/11;A61K48/00 |
| 代理公司： | 北京市柳沈律师事务所 11105 | 代理人： | 张文辉 |
| 地址： | 美国马*** | 国省代码： | 美国;US |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组酶 催化域 融合蛋白 可编程 位点 侧翼 核苷酸序列 内源性细胞 活性变体 细胞状态 核酸酶 基因组 酪氨酸 丝氨酸 无痕 修饰 细胞 | ||
1.融合蛋白，其包含：
(i)引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域；
(ii)接头；和
(iii)重组酶催化域。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域选自下组：核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域、核酸酶无活性的Cpf1域、核酸酶无活性的Argonaute域，及其变体。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述引导核苷酸序列-可编程DNA结合蛋白域是核酸酶无活性的Cas9(dCas9)域。
4.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQ ID NO:1中D10A或H840A突变的突变。
5.权利要求2-4中任一项的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含对应于SEQID NO:1中D10A突变的突变和对应于SEQ ID NO:1中H840A突变的突变。
6.权利要求2-5中任一项的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列进一步包含对应于SEQ ID NO:1中缺少的N-末端甲硫氨酸的突变。
7.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:712。
8.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有95％或更高的序列一致性。
9.权利要求2或3的融合蛋白，其中所述dCas9域的氨基酸序列与SEQ ID NO:712具有96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。
10.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶催化域是丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域。
11.权利要求10的融合蛋白，其中所述丝氨酸重组酶催化域或酪氨酸重组酶催化域选自Gin、Sin、Tn3、Hin、β、γδ、PhiC31、Cre或FLP重组酶催化域。
12.权利要求10或权利要求11的融合蛋白，其中所述Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含选自下组的一个或多个突变：SEQ ID NO:713中的H106Y、I127L、I136R或G137F突变。
13.权利要求11或权利要求12的融合蛋白，其中所述Gin重组酶催化域的氨基酸序列包含SEQ ID NO:713。
14.权利要求10或权利要求11的融合蛋白，其中所述Cre重组酶的氨基酸序列是截短的。
15.权利要求11或权利要求14的融合蛋白，其中所述酪氨酸重组酶催化域是所述Cre重组酶的25kDa羧基-末端域。
16.权利要求14的融合蛋白，其中所述Cre重组酶以氨基酸R118、A127、E138或R154开始。
17.权利要求1-16中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶的氨基酸序列已得以进一步突变。
18.前述权利要求中任一项的融合蛋白，其中所述重组酶催化域是经演化的重组酶催化域。
19.权利要求1-18中任一项的融合蛋白，其中所述接头具有约33埃至约81埃的长度。
20.权利要求1-19中任一项的融合蛋白，其中所述接头是肽接头。
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