[发明专利]用于冷冻保存高粘度生物样本的方法

说明书

本发明涉及用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，优选地是来自甲壳纲动物或昆虫的精子样本，借助于该方法，能够保持原始样本的物理特性完好，保存精包的活力。

技术领域

本发明涉及冷冻保存高粘度生物样本，诸如无脊椎动物的精子样本的方法，并且更具体地涉及能够冷冻保存非常高粘度的精子样本，例如甲壳纲动物的精子样本，完全维持这些样本中包含的精包的活力的新方法。

背景技术

生物组织和流体样本的冷冻保存是生物学中最广泛使用的保存技术之一，用于在长期时间内维持细胞存活并处于良好的状态，甚至不改变它们的外貌或代谢活动，为此目的冷冻保存维持组织和/或流体处于停滞期，其中细胞代谢活动完全停止，从而防止酶促降解过程发生。

为了实现上述目的，生物组织和/或流体的样本必须经过预先处理以减少由于温度骤降而形成晶体的可能性；这通过添加冷冻保护剂物质来实现，冷冻保护剂物质防止在冷冻过程期间形成晶体，这或是由于减少细胞内水的量和/或由于通过修改水分子之间的吸引力(例如通过破坏氢键)而改变它们的行为。

然而，尽管目前在长期时间内冷冻保存不同类型的样本是可能的，但在体外受精领域中存在更多的阻碍，因为考虑到在许多动物物种中损失例如精子的粘合力会阻止受精和产生存活的胚胎，因而不仅维持细胞存活是必要的，而且维持其细胞形态和生理特性完整也是重要的。

为了努力克服所述困难，已经开发出了各种冷冻保存方法，诸如在专利CN101703039 A中提出的方法，其描述了用于甲壳纲动物日本蟳(Charybdis japonica)的精子材料的稀释溶液，其功能是在将组织与为其在液氮罐中的保存而使用的冷冻保护剂接触之前使组织均匀化，旨在使精包与所使用的溶液直接接触。然而，所述冷冻保存方法完全稀释了样本，并导致其物理特性损失，损害了精子的受精能力。此外，在所述方法中仅使用DMSO作为冷冻保护剂，且没有描述其与维持渗透平衡的其它化合物的混合物。

专利EP 2641966 A1描述了用于生物样本的玻璃化过程的组合物，包括对细胞膜有渗透性的冷冻保护剂化合物和对细胞膜非渗透性的冷冻保护剂化合物，对细胞膜有渗透性的冷冻保护剂含量在相对于组合物总体积的30％至50％的范围内。然而，为了能够使用所提出的溶液，需要完全分解细胞样本，并因此损失了处理后样本的原始物理特性。

专利申请WO 2015057641 A1保护了用于冷冻保存组织的系统和进行生物样本的玻璃化的方法。所述应用的意义在于，它将所使用的玻璃化溶液描述为包含渗透性冷冻保护剂(DMSO)和非渗透性冷冻保护剂(海藻糖)。但是，没有提到使用其他溶液，也没有直接指出所使用的冷冻保护剂的浓度。此外，处理后的样本必须完全分解和悬浮以便与冷冻保护剂溶液接触，因此处理后的样本的原始物理特性将全部丧失。

在现有的冷冻保存方法中，没有一种能够处理高粘度生物样本而不需要将其完全分解。此外，在所有情况下都必须将样本完全悬浮并均匀化，以便它们能与所使用的冷冻保护剂紧密接触，因此，当意图保存精包的原始物理特性时，它们将不易被使用。

鉴于该问题，有必要提供一种用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够维持样本的原始物理特性，无需稀释它们以便被冷冻保存，且另外保存精包的活力完好。此外，有必要提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其在包含配子的情况下可保存它们的受精能力。

发明内容

本发明的主要目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的新方法。

本发明的另一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存这些样本的细胞活力。

本发明的又一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够冷冻保存无脊椎动物的精子样本，特别是甲壳纲动物、蜜蜂、蝴蝶或精子具有高粘度特点的任何其他无脊椎动物的精子样本。

本发明的另一目的是提供用于冷冻保存高粘度生物样本的方法，其能够保存无脊椎动物的样本中高细胞活力。