[发明专利]用于产生免疫缀合物的方法

说明书

本文中报道了一种通过在细胞培养基中培养含有一个或多个编码目的免疫缀合物的核酸的哺乳动物细胞、产生产物相关杂质和工艺相关杂质减少的免疫缀合物的方法，其中在细胞培养的条件下表达该一个或多个核酸，所述方法包括步骤：在细胞培养基中在第一温度和在第一pH培养哺乳动物细胞；降低细胞培养基的第一温度至第二温度，并升高细胞培养基的第一pH至第二pH；从细胞或细胞培养基回收免疫缀合物，由此产生免疫缀合物。

技术领域

本发明属于多肽生产和发酵工艺领域。本文中报道了用于产生免疫缀合物的新方法。

背景技术

癌症是全球最重大的死因。2012年，登记了820万死亡例；大部分由肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌引起。保守的癌疗法由以下治疗之一或其组合组成：手术、放疗和化疗(WHO 2014)。治疗癌症的另一种可能性是免疫疗法，刺激身体自身对癌症的免疫应答。细胞因子是参与免疫系统调节的细胞信号传导分子。在癌疗法中使用时，细胞因子可以充当具有抗肿瘤作用和可增加对某些类型肿瘤的免疫原性的免疫调节剂。在这个治疗领域，白介素-2(IL-2)是有效对抗人体癌症的首个药物。

IL-2是癌疗法中的强力分子。IL-2是在免疫应答中发挥关键作用的细胞因子。它在辅助T细胞(Th，CD4+)细胞中产生并且在其他免疫系统细胞(包括CD8+T细胞)中以较少的量产生。然而，(阿地白介素,aldesleukin)(IL-2市售形式)的临床应用有限，原因在于治疗期间分子的毒性高。已经开发了避免当前IL-2治疗之缺点的IL-2免疫缀合物。这些分子可以靶向肿瘤标记(TM)，并且因此在携带TM的肿瘤组织中实现IL-2的局部作用，或IL-2可以接合至无靶向作用的IgG分子，例如导致半寿期延长。此外，可以修饰IL-2本身和Fc区以降低分子的毒性(IL-2变体)。然而，在CHO细胞中产生IL-2免疫缀合物期间，观察到不同的产物相关和工艺相关杂质。这些杂质例如是具有碎片化细胞因子(IL-2)部分的分子、聚集的分子(高分子量种类；HMW)或宿主细胞蛋白如凝聚素(Clusterin)或磷脂酶B样2(PLBL2/PLB2)。在抗体中未观察到剪切，碎片化仅发生在IL-2分子中。根据FDA法规，产品必须避免任何异质性，包括聚集、变性和碎片化(Zoon,K.C.1997“Points to Consider inthe Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use”，美国卫生和公众服务部，美国食品药品监督管理局)。为了确保生物药剂对人体的安全性，必须移除生产过程期间累积的副产物并且需要从一开始就防止这些杂质的形成和积累。

在WO2008/131374中，描述了一种用于通过在降低的温度和/或降低的pH培育细胞培养物，减少细胞培养物中蛋白质错误折叠和聚集的方法。

Cruz等人(Biotechnology Letters,第677–682页,(2000))报道了固定化幼仓鼠肾细胞中表达的重组融合蛋白的产品质量，所述细胞在无蛋白质的培养基中培育。

在WO 2012/146628中，报道了选择性递送影响细胞活性的效应子部分的抗原特异性免疫缀合物。

Trummer等人(Biotechnol Bioeng,2006,94(6):1045-1052)描述了双相培养作为增强分批工艺的体积生产率的工具，所述分批工艺使用表达Epo-Fc的CHO细胞。

WO 2011/134919中报道了改进的细胞培养工艺。

发明简述

本文中报道了一种用于产生产物相关杂质水平和工艺相关杂质水平降低的免疫缀合物的方法。更详细地，已经发现，可以通过在第一时间段期间在第一(较高)温度和第一(较低)pH生长细胞培养物/培养细胞、随后转变温度至较低值并转变pH至较高值直至培养结束，来减少培养基中免疫缀合物的片段(例如，碎片化细胞因子如IL-2)、宿主细胞蛋白(例如，PLBL2或凝聚素)和聚集物的出现。