[发明专利]提高的衣康酸生产

说明书

本发明涉及通过抑制衣康酰‑CoA转移酶、衣康酰‑CoA水合酶(柠苹酰‑CoA水解酶；EC 4.2.1.56)和/或柠苹酰‑CoA裂解酶的表达或功能来增加微生物体中衣康酸生产的方法。还体现了微生物，优选土曲霉或黑曲霉，其中所述酶被抑制。

本发明涉及微生物生产领域，更具体地涉及衣康酸(衣康酸盐)的生产，更具体地涉及真菌中的衣康酸盐生产。

数十年来，衣康酸在微生物细胞中的生产和代谢已被广泛研究(Calam,C.T.等人,1939,Thom.J.Biochem.,33:1488-1495；Bentley,R.和Thiessen,C.P.,1956,J.Biol.Chem.226:673-720；Cooper,R.A.和Kornberg,H.L.,1964,Biochem.J.,91:82-91；Bonnarme,P.等人,1995,J.Bacteriol.117:3573-3578；Dwiarti,L.等人,2002,J.Biosci.Bioeng.1:29-33)，但衣康酸的代谢途径尚未明确地确定(Wilke,Th.和Vorlop,K.-D.,2001,Appl.Microbiol.Biotechnol.56:289-295；Bonnarme,P.等人,1995,J.Bacteriol.177:3573-3578)。在这方面的两个复杂因素是：衣康酸的生物合成途径被认为在细胞溶质和线粒体中发生(Jaklitsch,W.M.等人,1991,J.Gen.Microbiol.Appl.6:51-61)，以及已发现顺乌头酸酶(一种将柠檬酸互变为顺式乌头酸且反之亦然的酶)以及代谢途径中的其他酶在微生物细胞中以许多同种型存在。

衣康酸生产现在在土曲霉(Aspergillus terreus)中实现商业化，所述土曲霉与黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(A.oryzae)具有生理相似性。然而，后两者由于缺乏顺式乌头酸脱羧酶(CAD)活性而累积柠檬酸。这些真菌所使用的底物包括单糖和二糖，诸如葡萄糖、蔗糖和果糖以及淀粉(因为它们以可被微生物体降解的形式存在)、以及糖蜜。最近，已发现甘油也是土曲霉在衣康酸生产中的有用的底物(US 5,637,485)。

目前设想用于衣康酸生物合成的一般方案在图21中给出，其中明确描述了在胞质溶胶和线粒体中均存在生物合成途径，以及这两个隔室间的连接。在该方案的数个方面存在尝试改善微生物体中衣康酸的现有商业生产的可能性。

发明概述

本发明人现已发现所选用于增加衣康酸抗性和降低衣康酸降解和/或生化转化的突变体菌株，因此产生了提高水平的衣康酸。此外，本发明人已发现抑制衣康酰-CoA转移酶(EC 2.8.3.-)、衣康酰-CoA水合酶/柠苹酰-CoA水解酶(EC 4.2.1.56)或柠苹酰-CoA裂解酶(EC 4.1.3.25)的活性和/或抑制产生衣康酸的生物体(如曲霉属)中编码这些酶的基因的表达，能够克服由衣康酸引起的毒性作用并同时促进衣康酸生产。因此，本发明包括通过增加对衣康酸的毒性作用的抗性和降低衣康酸降解和/或生化转化来增加微生物体中衣康酸生产的方法。一种获得增加的衣康酸生产的方法是通过选择对衣康酸的毒性作用具有抗性的衣康酸生产生物体的突变体菌株。另一种方法是通过抑制酶衣康酰-CoA转移酶(EC2.8.3.-)和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶，EC 4.2.1.56)和/或柠苹酰-CoA裂解酶(EC 4.1.3.25)的功能或抑制编码这些酶的基因的表达。所述抑制可通过编码所述衣康酰-CoA转移酶和/或衣康酰-CoA水合酶(柠苹酰-CoA水解酶)和/或柠苹酰-CoA裂解酶(EC4.1.3.25)的基因的突变来实现，其中所述突变选自：

a)启动子突变或诱导型启动子插入；

b)编码序列突变，其选自一个或多个核苷酸的插入、缺失或改变；

c)蛋白结合位点插入；和

d)它们的组合。

在一个可替代的实施方案中，所述酶的表达被沉默，其可通过以下实现：

a)反义沉默；