[发明专利]通过扫描多个三维线来扫描感兴趣的区域的方法

说明书

本发明涉及一种使用3D激光扫描显微镜用给定速度沿着3D空间中的任意方向的基本直线(3D线)扫描的方法，所述3D激光扫描显微镜具有在x‑z平面偏转激光束的第一对声光偏转器(x轴偏转器)和在y‑z平面中偏转激光束的第二对声光偏转器(y轴偏转器)，用于在3D中聚焦激光束。本发明还涉及一种使用3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，3D激光扫描显微镜具有声光偏转器，用于在由显微镜的光轴(Z)和垂直于光轴以及彼此垂直的X、Y轴限定的3D空间内聚焦激光束。

技术领域

本发明涉及一种使用3D激光扫描显微镜以给定速度沿在3D空间中的任意方向上的基本直线(3D线)扫描的方法。

本发明还涉及一种利用具有声光偏转器的3D激光扫描显微镜扫描感兴趣的区域的方法，所述声光偏转器用于将激光束聚焦在3D空间内。

背景技术

神经元多样性、信息处理的层特异性、神经机制的区域特化、内部生成的模式和动态网络属性都表明理解神经计算需要不仅从单个平面或点而且以位于大型3D体积的大型神经元群体水平快速读出信息流和处理。此外，神经元网络内的编码和计算不仅由体细胞整合域形成，而且由高度非线性的树突整合中心形成，在大多数情况下，这些中心仍然不受体细胞记录的影响。因此，期望同时读出群体和单细胞水平的神经活动。此外，最近已经表明，在清醒和行为动物中神经元信令可能完全不同。因此，需要新的方法，其能够在行为动物的大脑中以大的扫描体积同时记录具有高空间和时间分辨率的神经元、树突、棘和轴突组件的活动模式。

最近已经开发了几种新的光学方法用于快速读出3D中的神经元网络活动。在用于多光子显微镜的可用3D扫描解决方案中，3D AO扫描能够执行3D随机接入点扫描(KatonaG,Szalay G,Maak P,Kaszas A,Veress M,Hillier D,Chiovini B,Vizi ES,Roska B,Rozsa B(2012)；Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.Nature methods 9:201-208)以与经典光栅扫描相比较将测量速度和信号采集效率提高几个数量级。这是因为预先选择的感兴趣的区域(ROI)可以被精确且快速地定向，而不会浪费不必要的背景体积的测量时间。更定量地，3D AO扫描增加了测量速度和信噪比的平方与总图像体积与预选扫描点覆盖的体积之比率的乘积。与相同样本体积的传统光栅扫描相比，该比率可以非常大，约每ROI 10⁶-10⁸。

尽管3D随机访问AO显微镜具有明显的好处，但该方法面临两个主要的技术限制：i)在活体记录期间荧光数据丢失或被大幅度运动伪影污染；ii)采样率受AO偏转器的大光学孔径尺寸的限制，AO偏转器必须用声波填充以解决给定的扫描点。出现第一个技术限制是因为记录的ROI的实际位置在活体测量期间由于由心跳、附近血管中的血流，呼吸和物理运动引起的组织运动而连续变化。由于各种荧光标记的基线荧光信号的空间不均匀性，这导致荧光伪影。此外，记录的隔室内的相对荧光变化也存在空间不均匀性；因此，体细胞(somata)或树突隔室内的测量位置不相等。此外，运动诱导的瞬变的幅度甚至可以大于由遗传编码的钙指示剂(GECI)检测到的一个或几个动作电位诱导的幅度。此外，Ca²⁺瞬变和运动伪影的动力学也可能非常相似。因此，事后很难将与神经活动相关的真正荧光变化与由脑运动引起的伪影分开。3D逐点扫描的第二个技术问题是相对较长的切换时间，这限制了测量速度或ROI的数量。这是因为为了实现具有高空间分辨率的大扫描体积，需要大的AO偏转器孔径。然而，用声学信号填充这些大孔径需要相当长的时间。因此，所得到的长持续时间AO切换时间不允许在适当的时间段内从单个点生成体积或表面元素。